El genoma de los organismos eucariotas y procariotas presenta un elevado número de elementos móviles cuya movilización se ha relacionado con procesos perjudiciales para el organismo que los alberga como por ejemplo recombinaciones cromosómicas pero también con procesos de reparación del DNA (Morrish, Gilbert et al.) y de ventaja adaptativa por adquisición de variabilidad génica (Levin and Moran). En tripanosomátidos se han identificado elementos móviles de tipo LINE que, a pesar de la divergencia evolutiva entre los organismos que los albergan, presentan una secuencia conservada de 77-79 nucleótidos en su extremo 5¿ denominada ¿Huella Pr77¿ (Bringaud, Ghedin et al.). La secuencia Pr77 del elemento móvil L1Tc de Trypanosoma cruzi se ha comprobado que presenta una función reguladora doble ya que en la molécula de DNA actúa como promotor interno (Heras, Lopez et al.) y en la molécula de RNA como ribozima autocatalítica de tipo HDV (Sanchez-Luque, Lopez et al.).
En esta tesis, se han seleccionado una serie de secuencias en el genoma de Trypanosoma brucei para su estudio como posibles secuencias activadoras de la transcripción basándonos en estudios de homología de secuencia con Pr77 de L1Tc. Las secuencias seleccionadas se corresponden con la secuencia de los primeros 78 nucleótidos de los elementos móviles ing, y RIME, que hemos denominado ingi78 y RIME78 respectivamente, así como dos secuencias de 78 nucleótidos que presentan homología con Pr77 pero que no se encuentran asociadas a elementos móviles. Estas últimas secuencias se localizan, una en el cromosoma 4 en medio de una agrupación policistrónica en orientación inversa a los genes, Pr4.1, y la otra en el cromosoma 6 en una strand switch region divergente, Pr6.1. Nuestros resultados indican que las secuencias ingi78, RIME78 y Pr6.1 son capaces de activar la transcripción génica en ensayos de gen reportero. Los transcritos que se generan de estas regiones no son procesados por trans splicing, pues no se detecta la secuencia del SL, a pesar de los cual son transcritos traducibles Además, las secuencias ingi78 y Pr6.1 son reconocidas por proteínas presentes en extractos nucleares de T. cruzi y T. brucei generando en ensayos de retardo en gel, complejos de movilidad retardada similares en ambos casos por lo que se puede deducir que las proteínas que reconocen a estas secuencias en los dos organismos deben presentar una elevada homología.
El único mecanismo de liberación del RNA de un retrotransposón co-transcrito desde una región promotora del hospedador descrito hasta la fecha está relacionado con la presencia de una ribozima de tipo HDV con actividad autocatalítica en el extremo 5¿ del RNA del elemento móvil (Eickbush and Eickbush ; Sanchez-Luque, Lopez et al.). En esta tesis hemos demostrado que la actividad ribozima de tipo HDV también está presente en el extremo 5¿ de la molécula de RNA de los elementos móviles ingi y RIME de T. brucei. La cinética del corte de estas ribozimas se ajusta al modelo previamente descrito para la ribozima de tipo HDV del retrotransposón R2 de Drosophila melanogaster previamente descrita (Eickbush and Eickbush). Además, el corte se produce en la posición +1 de los elementos móviles lo que asegura que la molécula de RNA generada porte la totalidad de la secuencia del elemento y por tanto, tras el proceso de retrotransposición, se generare una inserción completa. También hemos comprobado que el extremo 5¿ del producto 3¿ de corte presenta un radical hidroxilo que podría estar confiriendo estabilidad al RNA mensajero protegiéndolo de la degradación.
En tripanosomátidos todos los estudios encaminados a la identificación de factores de transcripción se han realizado, hasta la fecha, sobre la región promotora de la transcripción de los genes del Sl (Thomas, Yu et al.) En esta tesis se han estudiado factores de transcripción asociados a la secuencia promotora Pr77 de L1Tc en T. cruzi. La purificación de la proteína recombinante TBP de T. cruzi, cuya asociación a promotores dependientes de polimerasa I, II y III ha sido descrita en diferentes tripanosomátidos (Ruan, Arhin et al.), ha permitido la producción de anticuerpos monoclonales frente a ella. Mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta hemos podido localizar a TBPTc en el núcleo de epimastigotes de T. cruzi y por ensayos de retardo en gel con anticuerpos anti-rTBPTc hemos comprobado su implicación en la formación de los complejos proteína-Pr77 si bien la interacción entre TBP y Pr77 parece no ser directa y estar mediada por otra u otras proteínas.
Bringaud, F., E. Ghedin, et al. (2006). "Evolution of non-LTR retrotransposons in the trypanosomatid genomes: Leishmania major has lost the active elements." Mol Biochem Parasitol 145(2): 158-170.
Eickbush, D. G. and T. H. Eickbush (2011). "R2 retrotransposons encode a self-cleaving ribozyme for processing from an rRNA cotranscript." Mol Cell Biol 30(13): 3142-3150.
Heras, S. R., M. C. Lopez, et al. (2007). "The L1Tc non-LTR retrotransposon of Trypanosoma cruzi contains an internal RNA-pol II-dependent promoter that strongly activates gene transcription and generates unspliced transcripts." Nucleic Acids Res 35(7): 2199-2214.
Levin, H. L. and J. V. Moran (2011). "Dynamic interactions between transposable elements and their hosts." Nat Rev Genet 12(9): 615-627.
Morrish, T. A., N. Gilbert, et al. (2002). "DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition." Nat Genet 31(2): 159-165.
Ruan, J. P., G. K. Arhin, et al. (2004). "Functional characterization of a Trypanosoma brucei TATA-binding protein-related factor points to a universal regulator of transcription in trypanosomes." Mol Cell Biol 24(21): 9610-9618.
Sanchez-Luque, F. J., M. C. Lopez, et al. (2011). "Identification of an hepatitis delta virus-like ribozyme at the mRNA 5'-end of the L1Tc retrotransposon from Trypanosoma cruzi." Nucleic Acids Res 39(18): 8065-8077.
Thomas, S., M. C. Yu, et al. (2006). "A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters." Int J Parasitol 36(10-11): 1217-1226.
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