Resumen de Leucemia linfoblástica aguda pro b del lactante mll-af4+: avances en la etiología y origen celular mediante el uso de células troncales embrionarias y mesenquimales
Cada vez es más evidente la relación entre células madre y cáncer, sugiriéndose que el cáncer tiene su origen en una población de células madre. Esta teoría se fundamenta mayoritariamente en dos explicaciones biológicas; i) las células madre viven y crecen durante largos periodos de tiempo por lo que son más susceptibles a acumular lesiones genéticas a lo largo de los años y ii) debido a su escasez, a su estado de quiescencia y a la expresión de proteínas de resistencia a drogas son difícilmente destruidas con agentes citotóxicos, es decir, con ciclos de quimioterapia y/o radioterapia. Es importante destacar, que nuestro conocimiento sobre aspectos etiológicos del cáncer es limitado si trabajamos con muestras primarias procedentes de pacientes, ya que en el momento del diagnóstico, todos los eventos oncogénicos responsables están ya presentes, impidiéndonos descifrar los factores que desencadenan la aparición de dichos eventos, así como la patogénesis y la evolución de la enfermedad. Es por ello necesario desarrollar modelos in vivo e in vitro que de alguna manera reproduzcan la enfermedad, con el objetivo de ampliar nuestros conocimientos sobre la etiología y fisiopatología de la enfermedad y permitir el desarrollo de futuros tratamientos.
La mayoría de estudios oncológicos se centran en tumores de origen adulto, en parte porque su incidencia es mayor. Sin embargo, el cáncer infantil presenta unas características biológicas y epidemiológicas distintas a las de los adultos, lo que hace que sea necesario su estudio como un grupo aparte. Estos niños no desarrollan la enfermedad como respuesta a una exposición inadecuada a agentes carcinogénicos medioambientales o dietéticos, sino que por el contrario, más del 75% de los niños con cáncer ya presentan en el momento del nacimiento los eventos oncogénicos ocurridos en el útero. Además, en algún subtipo de cáncer infantil la edad en la que irrumpe es dramáticamente temprana, avalando la idea de que el cáncer infantil puede ser el resultado de una alteración en el desarrollo embrionario (Greaves, 2002).
En el caso concreto de la leucemia infantil (niños < 1 año), representa mayoritariamente una leucemia linfoblástica aguda (LLA) de linfocitos en estadio pro-B. La LLA pro-B del lactante MLL-AF4+, se caracteriza por su extremada corta latencia y gran agresividad. En los últimos años hemos avanzado vertiginosamente en la comprensión de la etiología de dicha LLA del lactante. El desencadenante molecular de dicha leucemia es el reordenamiento del gen MLL (localizado en el cromosoma 11q23). Dicho gen, se rompe entre el exón 6-9 y se reordena por NHEJ (non-homologous end joining) con el factor de transcripción AF4. En consecuencia, en las células sanguíneas del embrión o feto se origina el gen de fusión MLL-AF4. Dicha fusión origina la proteína de fusión MLL-AF4 que pasa a ser un dominante negativo y represor transcripcional de todo el programa de diferenciación hematopoyético. Aunque se reconoce el origen pre-natal de la fusión MLL-AF4, desconocemos por completo el origen celular de MLL-AF4. En realidad, el origen celular a nivel jerárquico dónde ocurre dicha alteración cromosómica es difícil de descifrar, debido a que el impacto funcional del oncogén de fusión y la expansión clonal resultante, puede ocurrir aguas abajo del propio origen físico de la traslocación. Lo que sí parece evidente, es que la célula diana donde aparece dicho oncogén de fusión debe de ser una célula troncal ontogénicamente temprana. En los últimos años, estudios epidemiológicos y celulares han demostrado que existe un claro componente genotóxico capaz de romper específicamente el factor de transcripción hematopoyético MLL en el embrión o feto, pero no en la madre embarazada (Moneypenny et al., 2006). Entre los posibles agentes genotóxicos, el más estudiado es el etopósido. El etopósido es un inhibidor de la topoisomerasa II que está presente en dietas ricas en bioflavonoides HIPÓTESIS Si partimos de la hipótesis de que el cáncer infantil tiene un origen embrionario/fetal (Greaves, 2005), necesitaríamos utilizar células en estadios ontogénicos muy tempranos como son las células troncales embrionarias humanas (en adelante, hESC, siglas inglesas de Human Embryonic Stem Cells), fetales o neonatales, y así poder estudiar y poder llegar, incluso, a reproducir esta enfermedad en células en un estadio de desarrollo muy cercanas al origen celular/temporal del cáncer infantil. Sin embargo, cualquier intento de emplear las hESCs como herramienta biológica para el desarrollo de modelos de cáncer requiere que dichas hESCs sean genéticamente lo más estables posibles, para evitar la acumulación basal de eventos oncogénicos y alteraciones cromosómicas que harían a dichas células vulnerables a transformación celular. Por ello, creemos importante conocer de forma prospectiva, y empleando técnicas citogenéticas y moleculares, la estabilidad genética de las hESCs y como afectan las condiciones de cultivo, el número de pases, y las propias propiedades biológicas intrínsecas a la estabilidad genética de las hESCs. Finalmente, se ha sugerido la existencia durante el desarrollo embrionario de precursores mesodérmicos capaces de originar diferentes tejidos de origen mesodérmico tales como sangre y mesénquima (estroma medular). De hecho, es de reseñar la implicación del estroma medular en la patogénesis de una amplia variedad de tumores hematopoyéticos. Las células troncales mesenquimales, (en adelante, MSCs, siglas inglesas de Mesenchymal Stem Cells) son componentes claves del microambiente hematopoyético y se están realizando esfuerzos importantes para evaluar su, hasta ahora desconocida, implicación en el origen y patogénesis de tumores hematopoyéticos.
Tras estas premisas nosotros pensamos, que las traslocaciones cromosómicas asociadas a leucemias infantiles podrían estar presentes en las MSCs de la médula ósea de estos pacientes pediátricos, de forma que durante el desarrollo embrionario humano los oncogenes de fusión pueden emerger en una población de precursores pre-hematopoyéticos mesodérmicos capaces de originar tanto HSCs como MSCs. Fundamentamos esta hipótesis en los siguientes puntos: 1. Una proporción de leucemias agudas carecen de expresión del marcador pan-leucocitario CD45, indicando que la leucemia podría tener un origen pre-hematopoyético. 3. Un porcentaje de los tumores secundarios a leucemias infantiles son tumores mesenquimales (Kersun et al., 2004), sugiriendo que el tratamiento citotóxico destruye el clon tumoral hematopoyético pero no las posibles MSCs que forman parte del clon maligno. 3. Las MSCs son más resistentes a la quimioterapia como indica el hecho de que la reconstitución del estroma post-transplante alogénico procede del receptor y muy infrecuentemente del donante (Garcia-Castro et al., 2007; Rieger et al., 2005) OBJETIVOS 1º Determinar mediante técnicas de citogenética convencional y molecular en qué grado la predisposición a inestabilidad genética en hESCs es debida a las condiciones de cultivo empleadas o a propiedades intrínsecas de cada línea celular.
2º Determinar si el etopósido es capaz de romper y provocar reordenamiento del locus MLL en hESCs, la progenie hematopoyética derivada de hESCs y en células CD34+ de cordón umbilical, y si dichos reordenamientos son suficientes para inducir transformación oncogénica en las hESCs.
3º Analizar en distintos subtipos citogenéticos de leucemias agudas infantiles y pediátricas si las traslocaciones cromosómicas presentes en los blastos están también presentes en el estroma medular, lo que sugeriría que la traslocación cromosómica tendría un posible origen pre-hematopoyético.
MATERIALES, MÉTODOS Y RESULTADOS La metodología desarrollada en esta memoria para llegar a los resultados obtenidos y expuestos en la tesis, quedan descritos en las publicaciones que forman parte de la misma, con el resumen que sigue a continuación se quiere hacer una breve descripción del desarrollo del trabajo. En este trabajo se ha determinado la estabilidad genética de las hESCs mediante técnicas de citogenética convencional y molecular. Aquellas hESCs cariotípicamente euploides fueron expuestas a bajas dosis de etopósido para analizar si el etopósido es capaz de promover rupturas en el locus MLL en estas células madre pluripotentes pre-natales. Dada la corta latencia de la LLA-B pro-B del lactante MLL-AF4+, su comportamiento bifenotípico y su origen pre-natal, quisimos analizar también, si puede tener un origen pre-hematopoyético de forma que el oncogén de fusión MLL-AF4 ya esté presente al diagnóstico en células no hematopoyéticas de la médula ósea, en concreto células troncales mesenquimales y para ello se estudió mediante FISH la presencia de las translocaciones características de dichas leucemias. Los resultados están descritos en las siguientes publicaciones que forman parte de e la tesis:
En relación al objetivo 1º planteado y relacionado con la estabilidad genética de las hESCs y propensión a diferenciación hematopoyética:
1. Catalina, P., Montes, R., Ligero, G., Sanchez, L., de la Cueva, T., Bueno, C., Leone, P.E. and Menendez, P. Human ESCs predisposition to karyotypic instability: Is a matter of culture adaptation or differential vulnerability among hESC lines due to inherent properties? Mol Cancer 7 (2008), p. 76-84.
2. Catalina, P., Bueno, C., Montes, R., Nieto, A., Ligero, G., Sanchez, L., Jara, M., Rasillo, A., Orfao, A., Cigudosa, J., Hovatta, O., Greaves, M. and Menendez, P. Genetic stability of human embryonic stem cells: A first-step toward the development of potential hESC-based systems for modeling childhood leukemia. Leuk Res 33 (2009), pp. 980-90.
En relación al objetivo 2º relacionado con la vulnerabilidad de las hESCs y células fetales CD34+ a un agente genotóxico: 3. Bueno, C., Catalina, P., Melen, G.J., Montes, R., Sanchez, L., Ligero, G., Garcia-Perez, J.L. and Menendez, P. Etoposide induces MLL rearrangements and other chromosomal abnormalities in human embryonic stem cells. Carcinogenesis 30 (2009), pp. 1628-37.
En relación al objetivo 3º dirigido a profundizar sobre el origen de la traslocación MLL-AF4 4. Menendez, P., Catalina, P., Rodriguez, R., Melen, G.J., Bueno, C., Arriero, M., Garcia-Sanchez, F., Lassaletta, A., Garcia-Sanz, R. and Garcia-Castro, J. Bone marrow mesenchymal stem cells from infants with MLL-AF4+ acute leukemia harbor and express the MLL-AF4 fusion gene. J Exp Med 206 (2009), pp. 3131-41 CONCLUSIONES 1. El uso de hESCs como modelo de enfermedad, requiere que las células sean genéticamente lo más estables posible. Si no fuera así podrían presentar alteraciones que pueden cooperar en la transformación de las hESCs o alterar la homeostasis del cultivo.
2. Es importante implementar técnicas citogenéticas convencionales y de alta resolución con el fin de detectar pequeñas pero relevantes anomalías cromosómicas.
3. Las condiciones de cultivo de las hESCs estandarizadas, y la duración del mismo, no determinan por si solos la tendencia de algunas líneas de hESCs a ser más propensas a adquirir alteraciones cromosómicas, sino que este hecho es inherente a la naturaleza de la propia línea celular.
4. El etopósido induce roturas en el gen MLL en hESCs y en células hematopoyéticas diferenciadas a partir de las hESCs, pero no proporciona ninguna ventaja proliferativa ni de supervivencia en estas células, ya que incluso la proporción de células con rotura de MLL disminuye con el tiempo.
5. La continua exposición a etopósido, además de producir la rotura de MLL, provoca otras alteraciones cromosómicas en hESCs. Por lo tanto, una exposición crónica a etopósido durante el desarrollo embrionario temprano puede inducir reordenamientos de MLL y hacer a las hESCs más propensas a la adquisición de alteraciones cromosómicas.
6. En células CD34+ neonatales, la exposición crónica a etopósido provoca rotura de MLL. Sin embargo, los datos de citogenética convencional y SKY revelan que la exposición continua a etopósido no induce alteraciones cromosómicas adicionales como sí ocurría en las hESCs.
7. El gen de fusión MLL-AF4 está presente y se expresa en las MSCs de médula ósea en el 100% de los lactantes diagnosticados con una LLA pro-B MLL-AF4+.
8. Otros genes de fusión asociados a leucemia linfoblastica aguda pediátrica no están presentes en MSCs de médula ósea, lo que apoya la especificdad de los resultados encontrados para MLL-AF4.
9. Las MSCs constituyen parte del clon tumoral, revelando por primera vez el importante papel del estroma medular en la patogénesis de la LLA pro-B del lactante con traslocación t(4;11) MLL-AF4. Además, parece plausible la sugerencia de un origen pre-hematopoyético de MLL-AF4, que tendría su origen en una población de precursores mesodérmicos capaces de diferenciarse hacía linaje hematopoyético y mesenquima Bibliografía Garcia-Castro, J., Balas, A., Ramirez, M., Perez-Martinez, A., Madero, L., Gonzalez-Vicent, M., and Diaz, M.A. (2007). Mesenchymal stem cells are of recipient origin in pediatric transplantations using umbilical cord blood, peripheral blood, or bone marrow. J Pediatr Hematol Oncol 29, 388-392. Greaves, M. (2002). Childhood leukaemia. BMJ 324, 283-287. Greaves, M. (2005). In utero origins of childhood leukaemia. Early Hum Dev 81, 123-129. Kersun, L.S., Wimmer, R.S., Hoot, A.C., and Meadows, A.T. (2004). Secondary malignant neoplasms of the bladder after cyclophosphamide treatment for childhood acute lymphocytic leukemia. Pediatr Blood Cancer 42, 289-291. Moneypenny, C.G., Shao, J., Song, Y., and Gallagher, E.P. (2006). MLL rearrangements are induced by low doses of etoposide in human fetal hematopoietic stem cells. Carcinogenesis 27, 874-881. Rieger, K., Marinets, O., Fietz, T., Korper, S., Sommer, D., Mucke, C., Reufi, B., Blau, W.I., Thiel, E., and Knauf, W.U. (2005). Mesenchymal stem cells remain of host origin even a long time after allogeneic peripheral blood stem cell or bone marrow transplantation. Exp Hematol 33, 605-611.
