Identificación de polimorfismos génicos relacionados con el sistema de defensa antioxidante implicados en la obesidad y el síndrome metabólico en niños
- Autores: Azahara Iris Rupérez Cano
- Directores de la Tesis: Ángel Gil Hernández (dir. tes.), Mercedes Gil Campos (codir. tes.), Concepción María Aguilera García (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Maria Dolores Suárez Ortega (presid.), Luis Fontana Gallego (secret.), José Alfredo Martínez Hernández (voc.), Pamela Simone Ruth Fischer Posovszky (voc.), José María Ordovás Muñoz (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
RESUMEN Introducción Según la Organización Mundial de la Salud la obesidad infantil es hoy en día un problema global que afecta a un gran número de países, así como un lastre para los sistemas de salud en todo el mundo (Gupta et al. 2012; Han et al. 2010).
La obesidad es una enfermedad compleja fruto de la unión de factores genéticos y ambientales, que en su conjunto incrementan la probabilidad de la enfermedad. Estudios desarrollados con gemelos, hermanos no gemelos y adoptados han permitido estimar que el componente genético contribuye desde un 40% a un 70% a la variación interindividual de la obesidad común (Elks et al. 2012). Así mismo, se ha observado que la influencia genética aumenta desde la infancia temprana hasta la adolescencia (Dubois et al. 2012). Gracias a los estudios de escaneo de genoma completo y de genes candidatos se ha demostrado la existencia de loci genéticos asociados con la forma más común de la obesidad (revisado por Rankinen et al. 2006 y Xia & Grant 2013).
La obesidad se caracteriza por una acumulación excesiva de tejido graso, que va acompañada por inflamación de bajo grado, alteración de la secreción de adipokinas, hipoxia y estrés oxidativo (Fernández-Sánchez et al. 2011). El estrés oxidativo se define como el desequilibrio entre la producción y degradación de especies reactivas de oxígeno (reactive oxygen species ROS) en el organismo. Las posibles causas de la relación entre la obesidad y un mayor estrés oxidativo pueden ser la hiperglucemia, un mayor nivel de ácidos grasos libres circulantes, una menor defensa antioxidante y la inflamación crónica asociada a la obesidad (Bondia-Pons et al. 2012, Furukawa et al. 2004).
El sistema de defensa antioxidante mantiene la homeostasis de ROS en el organismo. Comprende antioxidantes endógenos y exógenos. Los antioxidantes endógenos son fundamentalmente enzimas como glutatión peroxidasas (GPXs), catalasa (CAT), paraoxonasas (PONs), superóxido dismutasas (SODs) y peroxiredoxinas (PRDXs). Estas enzimas degradan las ROS a distintos niveles y compartimentos dentro y fuera de las células.
La presencia de polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms SNPs) puede afectar al funcionamiento de las enzimas antioxidantes y de ese modo incrementar el riesgo de algunas enfermedades como el cáncer (Da Costa et al. 2012). Sin embargo, el efecto de las variaciones genéticas en genes relacionados con el estrés oxidativo no se ha estudiado en profundidad en el contexto de la obesidad. Estudios que investiguen estos aspectos son necesarios para poder definir los mecanismos implicados en el desarrollo de las comorbilidades de la obesidad como el síndrome metabólico y la resistencia a la insulina.
Fundamento y objetivos El grupo de investigación CTS-461 ¿Bioquímica de la Nutrición. Implicaciones Terapéuticas¿ centra una de sus líneas de investigación en el estudio de la obesidad infantil mediante distintos métodos que incluyen el estudio de biomarcadores de obesidad novedosos, marcadores de estrés oxidativo y análisis de variaciones genéticas mediante estudios de asociación de genes candidatos. En un primer lugar, el estudio de la asociación de variantes genéticas con la obesidad se realizó en genes previamente relacionados con la obesidad como el 11ß-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (HSD11B1), neuropéptido Y (NPY), el gen asociado a obesidad y masa grasa (del inglés fat mass and obesity associated, FTO), entre otros. Estos genes se seleccionaron a partir de aquellos que se observaron sobreexpresados en el tejido adiposo visceral de niños prepúberes en un estudio llevado a cabo por nuestro grupo, además de los genes relacionados con masa grasa que se encontraban descritos en la bibliografía. A partir de este estudio se han publicado dos artículos que describen la asociación del SNP rs3753519 del gen HSD11B1 (Appendix, I) y de las variantes rs16147 y rs16131 del gen NPY (Appendix, II) con un mayor riesgo de obesidad en niños.
El objetivo de la presente tesis fue identificar las variaciones genéticas localizadas en genes del sistema de defensa antioxidante que afectaran al riesgo de obesidad en niños prepúberes españoles, así como estudiar su impacto sobre el estrés oxidativo y las complicaciones metabólicas asociadas a la obesidad como son la resistencia a la insulina, la inflamación y el daño endotelial.
Metodología Se trata de un estudio caso-control, transversal y multicéntrico que incluyó un total de 193 niños obesos (104 niños, 89 niñas) y 191 niños normopeso (110 niños, 81 niñas) reclutados en los centros de atención primaria de tres hospitales españoles: Hospital Universitario Reina Sofía y Valle de los Pedroches, ambos de Córdoba, y el Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. El protocolo se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética de cada uno de los centros participantes.
A cada niño se le realizaron las medidas antropométricas y se le tomó la tensión arterial y una muestra de sangre tras ayuno nocturno. El análisis bioquímico general se realizó en cada uno de los hospitales participantes. El análisis de adipoquinas y biomarcadores de inflamación y daño endotelial se realizó en el equipo Luminex 200 mediante la tecnología XMap. Así mismo, se determinaron mediante ELISA las concentraciones de LDL oxidada (LDLox) y de proteína de unión a ácidos grasos 4 (FAPB-4), la proteína C reactiva (hsCRP) se determinó mediante un análisis turbidimétrico. La concentración de vitaminas en plasma (retinol, ¿-tocoferol y ß-caroteno) se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución.
El sistema de defensa antioxidante se evaluó mediante la determinación de la capacidad antioxidante total del plasma (TAC), la actividad de las enzimas antioxidantes en eritrocitos [CAT, SOD, glutatión reductasa (GR) y GPX] y la actividad paraoxonasa 1 (PON1) en suero mediante distintos sustratos (paraoxon, fenilacetato, dihidrocumarina y diazoxón).
Mediante el uso de la base de datos dbSNP del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) se elaboró una lista de 492 SNPs localizados en 47 genes candidatos elegidos previamente. Los tag SNPs se eligieron utilizando la base de datos HapMap. El genotipado fue realizado mediante la tecnología GoldenGate de Illummina. Tras la obtención de los primeros resultados, se siguieron una serie de pasos para el control de calidad de los resultados. Posteriormente se realizó un análisis de regresión logística ajustado por sexo y edad para el estudio de la asociación de cada SNP con el riesgo de obesidad infantil. Así mismo, se realizó un análisis de regresión lineal ajustado por sexo y edad para observar el efecto de cada SNP sobre los fenotipos estudiados. Adicionalmente, se ajustó este análisis por índice de masa corporal (IMC) con el fin de caracterizar mejor las asociaciones observadas. Para estos análisis el software utilizado fue PLINK 1.07.
Resultados Análisis de antropometría y biomarcadores En el grupo de los niños obesos los valores del IMC, IMC z-score y la circunferencia de cintura (CC) fueron mayores que en niños normopeso. Las tensiones arteriales sistólica (TAS) y diastólica (TAD) también mostraron un aumento con la obesidad. Se observó que los niveles de insulina en ayunas, así como el valor del índice de resistencia a insulina estaban incrementados en niños obesos, mientras que el ínice de sensibilidad a la insulina era menor en niños obesos que en los normopeso. Los niveles de glucemia no mostraron diferencias. En cuanto al perfil lipídico, los niños obesos tenían menor concentración de colesterol total, colesterol HDL (lipoproteínas de alta densidad) y apolipoproteína A-I, y mayor concentración de triglicéridos, apolipoproteína B y FABP-4 que los niños normopeso. Las concentraciones de colesterol LDL (lipoproteínas de baja densidad) no mostraron diferencias entre grupos. Los niveles de resistina y leptina fueron mayores en niños obesos. Así mismo, las concentraciones de mieloperoxidasa, del inhibidor del activador del plasminógeno 1 activo y del total estaban aumentadas en los niños obesos, a diferencia de la concentración de metalopeptidasa 9, que no mostró diferencias significativas. Las interleukinas 6 y 8, la hsCRP y el factor de necrosis tumoral alfa estaban aumentados en el grupo de los niños obesos. La concentración de la proteína quimiotáctica de monocitos 1 no mostró diferencias entre grupos. La concentración de las transaminasas hepáticas alanina aminotransferasa y gamma-glutamil transpeptidasa fue mayor en niños obesos, y la de aspartato transaminasa fue menor en niños obesos frente a normopesos.
En cuanto al estado del estrés oxidativo, las LDLox no mostraron diferencias, mientras que la TAC fue significativamente menor en niños obesos. La actividad CAT se observó disminuída en eritrocitos de niños obesos, y no se observaron diferencias significativas en las actividades GR, GPX, SOD o PON1 entre grupos. Los niveles de las vitaminas ¿-tocoferol y ß-caroteno fueron significativamente menores en niños obesos, y no se observaron diferencias en la concentración de retinol.
Genotipado y análisis de asociación El estudio de asociación mostró que 19 SNPs del total de 492 analizados estaban asociados a la obesidad infantil. Un total de 7 SNPs incrementaban el riesgo de obesidad infantil, mientras que 12 SNPs conferían protección contra ella. Los SNPs están localizados en los siguientes genes: paraoxonasa 1 (PON1), catalasa (CAT), glutatión peroxidasas 4 (GPX4), 5 (GPX5) y 6 (GPX6), aldehído oxidasa 1 (AOX1), peroxiredoxina 5 (PRDX5), resistencia a la oxidación 1 (OXR1), respuesta al estrés oxidativo 1 (OXSR1) y sirtuína 2 (SIRT2).
Los resultados principales que se observaron en el estudio de asociación entre los SNPs protectores frente a la obesidad y los fenotipos estudiados fueron los siguientes: ¿ La variante rs854566 del gen PON1 se asoció a un menor riesgo de obesidad, a mayor actividad lactonasa, arilesterasa y diazoxonasa, y a menor actividad paraoxonasa de PON1 sérica en niños prepúberes (Chapter 3; Rupérez et al. 2013-a).
¿ Los SNPs rs475042 y rs494024 del gen CAT se asociaron a menor riesgo de obesidad infantil y a menor peso.
¿ Los SNPs rs757228, rs3746165 y rs8102188 del gen GPX4 se asociaron a menor riesgo de obesidad y a menores niveles de marcadores de estrés oxidativo.
¿ Las variantes rs3731722 y rs1050887 del gen AOX1 se asociaron a menor riesgo de obesidad y a menores valores leptina en niños prepúberes.
¿ El SNP rs4930698 del gen PRDX5 se asoció a menor riesgo de obesidad y a menores valores de biomarcadores de inflamación y daño endotelial en niños prepúberes.
¿ El SNP rs1681887 del gen OXR1 se asoció a menor riesgo de obesidad y a menores valores de marcadores de resistencia a la insulina y estrés oxidativo en niños prepúberes.
¿ El polimorfismo rs4955408 del gen OXSR1 se asoció negativamente a la obesidad infantil y sus fenotipos, así como a menor resistencia a la insulina, daño endotelial y estrés oxidativo.
El estudio de la asociación entre los SNPs asociados a mayor riesgo de obesidad y los fenotipos estudiados generó los siguientes resultados principales: ¿ Las variantes en el promotor del gen CAT rs769214, rs8693316 y rs1049982 se asociaron a un mayor riesgo de obesidad y a mayores valores de sus fenotipos (Chapter 4; Rupérez et al. 2013).
¿ Las variantes rs28382586 y rs445870 del gen GPX5 y rs406113 y rs11757000 del gen GPX6 se asociaron a un mayor riesgo de obesidad en niños prepúberes.
Discusión El aumento en la prevalencia de obesidad y sus alteraciones metabólicas asociadas como la diabetes de tipo 2 junto a la evidencia de estrés oxidativo asociado a la obesidad hacen necesario el estudio en profundidad de los mecanismos moleculares que conectan el estrés oxidativo con la obesidad.
Dada la ausencia de más información en este campo, nos dispusimos a llevar a cabo el estudio descrito en la presente tesis doctoral. Para tal fin, realizamos un estudio caso-control en un grupo de niños prepúberes españoles obesos y normopeso en los que estudiamos la asociación entre la presencia de SNPs en genes del sistema de defensa antioxidante y el estado de obesidad y los valores de un gran número de marcadores metabólicos implicados en la resistencia a la insulina, el estrés oxidativo, la inflamación y el daño endotelial.
El análisis de los fenotipos observados mostró los resultados esperados en cuanto a marcadores relacionados con la obesidad como son el peso, el IMC, la CC, o las TAS y TAD, que se observaron aumentados en niños obesos prepúberes. Los biomarcadores de resistencia a la insulina, de metabolismo lipídico, de inflamación y de daño endotelial como el MPO (Olza et al. 2012-b) también se vieron alterados con la obesidad en estos niños, contribuyendo a la presencia de síndrome metabólico (Olza et al. 2011). Un descubrimiento novedoso fue que los niños obesos mostraron un sistema de defensa antioxidante debilitado, indicado por menores valores de actividad CAT, de TAC, de ß-caroteno y de ¿-tocoferol (Rupérez et al. 2013-b). Estos datos concuerdan con los de otro estudio en el que se vieron mayores concentraciones de marcadores de estrés oxidativo como el malondialdehído y los grupos carbonilo, así como de actividad GPX, y menor concentración de glutatión reducido (GSH) en niños obesos. Sin embargo, en el mismo estudio no se encontraron diferencias en los valores de ß-caroteno y de ¿-tocoferol, posiblemente debido a que el estudio incluía un menor número de sujetos (Codoñer-Franch et al. 2010). En nuestro caso, no encontramos diferencias en las actividades de PON1, GR, GPX o SOD, ni en el marcador de estrés oxidativo LDLox. La edad temprana de nuestra población en estudio podría ser una de las causas de la ausencia de mayores alteraciones en el estado de estrés oxidativo. No obstante, los cambios mencionados en el estado de defensa antioxidante podrían ser el origen del incremento de estrés oxidativo observado en la obesidad y sus complicaciones metabólicas.
El análisis de SNPs que puedan afectar al funcionamiento de enzimas antioxidantes, y por tanto al riesgo de padecer enfermedades como la obesidad, es un posible abordaje para aclarar los mecanismos implicados en las comorbilidades de la obesidad. Aunque se han llevado a cabo muchos estudios para caracterizar la asociación entre SNPs y obesidad infantil, la mayoría se han concentrado en SNPs de genes relacionados con la obesidad (Yu et al. 2012; Wheeler et al. 2013) y muy pocos han estudiado SNPs de genes antioxidantes. Algunos de los resultados descritos incluyen los SNPs rs662 (Q192R) y rs854560 (L55M) del gen PON1, que no mostraron asociación con obesidad en adolescentes (Baráth et al. 2006). En otro estudio los autores encontraron el SNP Ala16Val del gen SOD2 asociado a la obesidad infantil en niños con hígado graso no alcohólico (El-Koofy et al. 2011). En nuestro estudio, analizamos 492 SNPs de genes del sistema de defensa antioxidante, de los cuales 12 resultaron ser protectores frente a la obesidad y 7 incrementaron el riesgo de obesidad en niños prepúberes. Ninguno de los SNPs descritos se había publicado previamente en lo que se refiere a su asociación con obesidad.
Uno de los principales descubrimientos de la presente tesis es el carácter protector de la variante génica rs854566 del gen PON1 en relación con la obesidad (Rupérez et al. 2013-a). Este SNP también se asoció a las actividades séricas de PON1 determinadas, diazoxonasa, lactonasa y arilesterasa. A pesar de estos resultados, las actividades PON1 no mostraron diferencias entre los grupos obeso y normopeso. Aún así, demostramos que la actividad lactonasa es un indicador fiable de la función de PON1, e insistimos en que debería ser utilizada en futuros estudios que tengan el objetivo de investigar el papel de PON1 en el desarrollo de la obesidad y la enfermedad cardiovascular.
Del mismo modo, describimos cómo el SNP rs769214 (-844A/G) del promotor del gen CAT estaba asociado con la obesidad infantil (Rupérez et al. 2013-b). Aunque esta variante génica no se asoció a la actividad CAT de eritrocitos, sí resultó estar asociada al FABP-4 en plasma, lo que podría indicar un posible papel de CAT en la disfunción del tejido adiposo presente en la obesidad.
También se encontraron un grupo de SNPs localizados en los genes GPX4, GPX5 y GPX6. En el gen GPX4, los SNPs rs757228, rs3746165 y rs8103188 de la región 5¿ se asociaron con menor riesgo de obesidad. Aunque estas variantes se asociaron con marcadores de obesidad y a mayor TAC, ninguno se asoció con la actividad GPX de eritrocitos. Del mismo modo, en un estudio reciente, el SNP rs757228 tampoco se asoció a activida GPX (Zanon-Moreno et al. 2013). Dos SNPs del gen GPX5 (rs28382586 y rs445870) mostraron estar asociados positivamente con la obesidad y sus fenotipos relacionados. En cuanto al gen GPX6, dos SNPs (rs406113 y rs11757000) mostraron asociación con mayor riesgo de obesidad infantil. Hacen falta más estudios para poder entender el papel de estas variantes en la actividad enzimática.
En el gen aldehído oxidasa 1 (AOX1) se encontraron dos SNPs (rs3731722 and rs1050887) asociados a menor obesidad infantil así como a menor IMC, CC, peso y leptina. En un estudio reciente, Hartmann et al. describieron cómo el SNP rs3731722 (H1297R) provocaba un incremento en la eficacia metabólica de AOX1 (Hartmann et al. 2012). Teniendo en cuenta ambos hechos, una posible hipótesis para un estudio posterior sería que una actividad detoxificante aumentada de AOX1 podría tener un efecto sobre el metabolismo y un papel en la protección frente a la obesidad.
De un modo similar, encontramos los SNPs rs4930698 (PRDX5), rs1681887 (OXR1), rs4955408 (OXSR1) y rs892034 (promotor SIRT2) asociados negativamente con la obesidad. Se sabe que SIRT2 tiene un efecto inhibidor sobre la diferenciación adipogénica (Jing et al. 2007). Por tanto, se podría hipotetizar que la presencia del SNP rs892034 en el promotor de SIRT2 podría incrementar su expresión en el tejido adiposo y así inhibir la diferenciación adipogénica, proporcionando una posible explicación de su función protectora frente a la obesidad.
Estos resultados deben ser validados en estudios con un mayor número de individuos, y en distintas poblaciones para asegurar la calidad de los descubrimientos. La realización de estudios in vivo e in vitro que investiguen la función de estas variantes génicas en el tejido adiposo será clave para elucidar el papel de defensa antioxidante de estas enzimas en la protección frente al desarrollo de la obesidad y sus comorbilidades.
Conclusión Los polimorfismos descritos localizados en genes del sistema de defensa antioxidante ejercen un efecto sobre el riesgo de obesidad en niños prepúberes españoles. Además, la presencia de estos SNPs influye sobre un gran número de fenotipos asociados con la obesidad, la resistencia a la insulina, la inflamación, el daño endotelial y el estrés oxidativo. Estos datos apoyan el papel del estrés oxidativo en la patogénesis de la obesidad y sus complicaciones metabólicas.
Limitaciones del estudio A pesar del tamaño considerable de nuestra población objeto de estudio, un mayor número de participantes habría incrementado la significación de los resultados. No hemos validado los resultados en otras poblaciones. La mayoría de los SNPs observados no tienen un papel claro en la regulación genética o en la proteína codificada, indicando que son probablemente SNPs marcadores y no SNPs causantes de la enfermedad. Las asociaciones observadas perdieron su significancia tras el ajuste por comparaciones múltiples de Bonferroni.
SUMMARY Introduction According to the World Health Organization childhood obesity is nowadays a global problem affecting a high number of low and middle-income countries, and having a big impact for healthcare systems worldwide (Gupta et al. 2012; Han et al. 2010).
Obesity is a complex trait that stems from a complicated network of contributory components, including genomic and environmental factors, the aggregations of which increase the probability of disease. Studies in twins, no-twin siblings, and adoptees have estimated that genetic components contribute from 40% to 70% to the inter-individual variation in common obesity (Elks et al. 2012). It should also be emphasized that heritability estimates have been shown to increase from early childhood through adolescence (Dubois et al. 2012). Genome-wide and candidate gene association studies have successfully revealed a variety of genetic loci associated with the more common form of obesity (reviewed by Rankinen et al. 2006 and Xia & Grant 2013).
Obesity is characterized by an excessive accumulation of fat in adipose tissue, which is accompanied by low-grade inflammation, adipokine secretion dysregulation, hypoxia and oxidative stress (Fernández-Sánchez et al. 2011). Oxidative stress is defined as an imbalance between the reactive oxygen species (ROS) scavenging and producing systems in the organism. The link between obesity and enhanced oxidative stress might be due to the hyperglycemia, high circulating free fatty acids, decreased antioxidant defenses and chronic inflammation associated with obesity (Bondia-Pons et al. 2012, Furukawa et al. 2004).
The antioxidant defense system maintains ROS homeostasis in the organism. It comprises both endogenous and exogenous antioxidants. Endogenous antioxidants primarily include enzymes such as glutathione peroxidases (GPXs), catalase (CAT), paraoxonases (PONs), superoxide dismutases (SODs) and peroxiredoxins (PRDXs). These enzymes degrade ROS at different levels and in different compartments inside and outside of the cells.
It is known that the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) can affect the functioning of antioxidant enzymes and increase the risk of certain diseases, such as cancer (Da Costa et al. 2012). However, to our knowledge, the impact of genetic variations in the genes associated with oxidative stress has not been fully studied within the context of obesity. Detailed studies in this field could clarify the mechanisms involved in the development of the comorbidities of obesity, such as metabolic syndrome and insulin resistance.
Rationale and aims of the study The research group CTS-461 ¿Biochemistry of Nutrition. Therapeutical implications¿ focuses one of its lines of work on childhood obesity through different approaches including the study of novel obesity biomarkers, oxidative stress markers and genetic variation analyses through candidate gene association studies. The first approach in the study of the association of genetic variants with childhood obesity was to observe SNPs from obesity-related genes such as 11ß-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (HSD11B1), neuropeptide Y (NPY), fat mass and obesity (FTO), among others. These genes were selected within those previously found by our group to be overexpressed in visceral adipose tissue of chidren at prepubertal age or those described in the literature as associated to fat mass. Arising from this study, two articles have been published describing the association of SNP rs3753519 from the HSD11B1 gene (Appendix I) and variants rs16147 and rs16131 in the NPY gene (Appendix II) with higher childhood obesity risk.
The aim of the present thesis was to identify genetic variants of genes related to the antioxidant defense system that affect the risk of obesity in Spanish prepubertal children, as well as to study their impact on oxidative stress status and obesity metabolic complications such as insulin resistance, inflammation and endothelial damage.
Methodology The present study is a case-control, cross-sectional, multicentre study that included a total of 193 obese (104 boys and 89 girls) and 191 normal-weight (110 boys and 81 girls) children recruited from primary care centers at three Spanish hospitals: University Hospital ¿Reina Sofía¿ and Hospital ¿Valle de los Pedroches¿, both in Córdoba; and Clinical University Hospital of Santiago de Compostela. The study followed the Helsinki Declaration for Clinical Studies and permissions were obtained from the Ethics Committee of all Centers.
Blood pressure and anthropometric measurements were performed and blood samples were drawn after overnight fasting. A general biochemical analysis was run at the participating hospitals. Plasma adipokines and biomarkers of inflammation and endothelial damage were measured by Luminex 200 equipment using XMap technology. In addition, oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) and fatty acid-binding protein 4 (FABP-4) were measured by ELISA and high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) was determined with a turbidimetric assay. The vitamins retinol, ¿-tocopherol and ß-carotene plasma levels were analyzed by high-pressure liquid chromatography.
The antioxidant defense system was evaluated by assessing the total antioxidant capacity of plasma (TAC), the activity of the antioxidant enzymes in erythrocytes [CAT, SOD, glutathione reductase (GR) and GPX] and serum paraoxonase 1 (PON1) activities measured with different substrates (paraoxon, phenylacetate, dihydrocoumarin and diazoxon).
A list of 47 candidate genes related with oxidative stress was prepared and 492 SNPs were selected by using the National Center for Biotechnology Information database (dbSNP). Tag SNP selection was done with the HapMap database. For genotyping, the Illumina GoldenGate technology was used. After obtaining the raw results, quality control steps were followed to remove poor quality data. Then, a logistic regression analysis adjusted by sex and age was conducted to study the association of each SNP with the risk of childhood obesity. In the same way, a linear regression model adjusted by sex and age was applied to study the association between the SNPs and the studied phenotypes. An additional adjustment by body mass index (BMI) was conducted in order to better characterize the observed associations. PLINK 1.07 software was used for the bioinformatic analyses.
Results Anthropometry and biomarker analysis Obese children showed significantly higher weight, BMI, BMI z-score and waist circumference. Systolic and diastolic blood pressures were also significantly increased with obesity in these children. Fasting insulin and homeostasis model assessment for insulin resistance index were significantly higher and quantitative insulin sensitivity check index was significantly lower in obese children, whereas fasting glucose values did not differ between obese and normal-weight children. Total cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol and apolipoprotein A-I were significantly lower in obese children. On the contrary, triacylclycerols, apolipoprotein B and FABP-4 were higher in the obese compared to normal-weight children. Low-density lipoprotein was not significantly different between groups. Fasting plasma concentrations of resistin and leptin were significantly higher in obese than in normal-weight subjects, by contrast decreased levels of adiponectin were found in obese. Myeloperoxidase, active and total plasminogen activator inhibitor 1 were significantly higher in the obese group compared to the normal-weight group, whereas matrix metallopeptidase 9 was not. HsCRP, interleukin 6, interleukin 8 and tumor necrosis factor alpha (TNF-¿) were significantly higher in the obese group compared to the normal-weight group, whereas monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) concentration did not show any difference between groups. Liver transaminases alanine aminotransferase and gamma-glutamil transferase were significantly higher in obese children, whereas aspartate aminotransferase was lower.
Concerning oxidative stress status, ox-LDL was not significantly different between the groups, whereas TAC was significantly lower in obese children. CAT activity in erythrocytes was found to be significantly lower in obese children, but no differences were observed between erythrocyte enzymatic activities of GR, GPX, SOD or PON1 between obese and normal-weight children. The analyzed vitamins ¿-tocopherol and ß-carotene were significantly lower in obese children, with no differences found in retinol between groups.
Genotyping and association analyses The association analysis showed that 19 SNPs out of the total of 492 analyzed were associated with childhood obesity. A total of 7 SNPs increased childhood obesity risk, whereas 12 SNPs conferred protection against it. The SNPs found are located in the following genes: paraoxonase 1 (PON1), catalase (CAT), glutathione peroxidases 4 (GPX4), 5 (GPX5) and 6 (GPX6), aldehyde oxidase 1 (AOX1), peroxiredoxin 5 (PRDX5), oxidation resistance 1 (OXR1), oxidative stress responsive 1 (OXSR1) and sirtuin 2 (SIRT2).
The main results from the linear regression analysis of SNPs negatively associated with obesity and the studied phenotypes were the following: ¿ The variant rs854566 in PON1 gene was associated with lower obesity risk and higher lactonase, arylesterase and diazoxonase activities and lower paraoxonase activity of serum paraoxonase 1 in prepubertal children (Chapter 3; Rupérez et al. 2013).
¿ SNPs rs475043 and rs494024 from the CAT gene were associated with a lower childhood obesity risk as seen by their association with lower weight.
¿ SNPs rs757228, rs3746165 and rs8102188 of the GPX4 gene were associated with lower childhood obesity risk and lower values of oxidative stress markers.
¿ The variants rs3731722 and rs1050887 from the AOX1 gene were associated with lower obesity risk and lower values of leptin in prepubertal children.
¿ The SNP rs4930698 from the PRDX5 gene was found to be associated with lower obesity risk and lower values biomarkers of inflammation and endothelial damage in prepubertal children.
¿ The SNP rs1681887 from the OXR1 gene was associated with lower obesity risk and lower values insulin resistance and oxidative stress biomarkers in prepubertal children.
¿ The polymorphism rs4955408 from the OXSR1 gene was negatively associated with childhood obesity and its phenotypes and with lower insulin resistance, endothelial damage and oxidative stress biomarkers.
The results from the linear regression analysis of SNPs positively associated with obesity and the studied phenotypes are the following: ¿ Variants from the CAT gene promoter rs769214, rs7693316 and rs1049982 were associated with higher childhood obesity risk and obesity phenotypes (Chapter 4; Rupérez et al. 2013).
¿ The variants rs28382586 and rs445870 from the GPX5 gene and rs406113 and rs11757000 from the GPX6 gene were associated with higher obesity risk in prepubertal children.
Discussion The continuing increase in the prevalence of obesity and its associated metabolic disorders such as type 2 diabetes together with the evidence of obesity-induced oxidative stress highlights the need of investigating the molecular mechanisms linking oxidative stress and obesity.
Due to the absence of more information in this field, we were encouraged to carry out this research in the present PhD thesis. We conducted a case-control study in a group of prepubertal obese and normal-weight Spanish children in which we studied the association between SNPs for antioxidant defense system genes and the presence of obesity and metabolic traits involved in insulin resistance, oxidative stress, inflammation and endothelial dysfunction.
The phenotype analysis showed the expected findings concerning obesity-related traits such as weight, BMI, WC, SBP and DBP, which were observed to be increased in prepubertal obese children. Insulin resistance biomarkers, lipid profile, adipokines and biomarkers of inflammation and endothelial damage such as MPO (Olza et al. 2012-b) were also found to be altered in prepubertal obesity, contributing to the presence of metabolic syndrome in children (Olza et al. 2011). A novel finding was the fact that obese children showed a decreased antioxidant defense as seen by lower erythrocyte CAT activity, lower TAC and lower levels of ß-carotene and ¿-tocopherol (Rupérez et al. 2013-b). These findings are in line as those describing higher levels of oxidative stress markers such as malondialdehyde, carbonyl groups and GPX activity and lower levels of GSH in obese children. However, the same study found no differences in ß-carotene and ¿-tocopherol possibly due to the smaller number of subjects included in the study (Codoñer-Franch et al. 2010). In contrast, we observed no differences in PON1, GR, GPX or SOD activities or in the oxidative stress marker ox-LDL. The young character of this population could explain the absence of greater alterations in the observed oxidative stress status. Nevertheless, the presence of the mentioned changes in antioxidant defenses could indicate a possible origin of the enhanced oxidative stress implicated in the metabolic complications of obesity.
The analysis of SNPs that can affect the functioning of antioxidant enzymes and thus the risk of diseases such as obesity is a potential approach to elucidate the mechanisms involved in the comorbidities of obesity. Although many studies have been conducted to characterize the association between obesity-related SNPs and childhood obesity (Yu et al. 2012; Wheeler et al. 2013), the studies of variants in genes of antioxidant defense are almost inexistent. Some of the previous findings include SNPs rs662 (Q192R) and rs854560 (L55M) from the PON1 gene, which failed to show association with obesity in adolescents (Baráth et al. 2006). In another study the authors showed the Ala16Val SNP from the SOD2 gene to be associated with obesity in children with non-alcoholic steatohepatitis (El-Koofy et al. 2011). Here, we analyzed 492 SNPs for antioxidant defense genes of which 12 showed protection against obesity and 7 increased risk of obesity in prepubertal children. None of the found SNPs had been previously published regarding their association with obesity.
One of the main findings presented in this thesis is the protective role of the variant rs854566 of the PON1 gene with respect to obesity (Rupérez et al. 2013-a). This SNP also exhibited strong associations with serum PON1 activities, namely increased diazoxonase, lactonase and arylesterase activities. Despite these results, serum PON1 activities were not found to be significantly different in prepubertal obese children. Nevertheless, we demonstrated that lactonase activity is a reliable indicator of PON1 function and should be used in future studies investigating the role of PON1 in the development of obesity and cardiovascular disease.
In the same way, we described how the SNP rs769214 (-844A/G) of the CAT gene promoter was associated with childhood obesity (Rupérez et al. 2013-b). Although this variant was not associated with CAT activity, it was associated with FABP-4 levels which could indicate a role of CAT in adipose tissue dysfunction present in obesity.
A variety of SNPs were also found in three GPX genes, GPX4, GPX5 and GPX6. In the GPX4 gene we found the SNPs rs757228, rs3746165 and rs8103188 in the 5¿-UTR to be associated with lower obesity risk. Although these variants were associated with obesity markers, as well as with higher TAC, none of them was found to be associated with GPX activity in erythrocytes. Like ways, the SNP rs757228 was not associated with GPX activity in a previous study by Zanon-Moreno et al. (2013). Two SNPs from GPX5 (rs28382586 and rs445870) were positively associated with obesity in children and the presence of the risk alleles of these SNPs was also associated with an increase in obesity related phenotypes. Concerning GPX6, two SNPs were found in this gene to be associated with a higher childhood obesity risk, rs406113 and rs11757000. Further studies should be carried out in order to understand the role of these variants on enzyme activity.
Two SNPs (rs3731722 and rs1050887) in the aldehyde oxidase 1 gene (AOX1) showed association with lower obesity and with lower BMI, WC, weight and leptin in children. Regarding this variant, there is one previous study were Hartmann et al. described how the SNP rs3731722 (also called H1297R) has an impact increasing the metabolizing efficiency of AOX1 (Hartmann et al. 2012). Taken together, this could mean that an enhanced detoxifying activity of AOX1 might have an impact on metabolism and a role in the protection against obesity.
In a similar way, we found SNPs rs4930698 (PRDX5), rs1681887 (OXR1), rs4955408 (OXSR1) and rs892034 (SIRT2 promoter) to be negatively associated with obesity. It is known that SIRT2 mediates an inhibitory effect on adipocyte differentiation (Jing et al. 2007). Thus, it could be hypothesized that the presence of rs892034 in the promoter of SIRT2 could increase its expression in adipose tissue and inhibit differentiation, thus providing a possible explanation of this SNP¿s function protecting against obesity.
These results must be validated in larger and different populations in order to ensure the quality of the findings. Future in vivo and in vitro studies on the function of some of these variants in adipose tissue may help us to identify potential antioxidant and protective roles for these enzymes in the protection against the development of obesity and its co-morbidities.
¿ Conclusion The found SNPs in antioxidant defense system genes have an impact on obesity risk in prepubertal Spanish children. Moreover, the presence of the SNPs influences a variety of phenotypes associated with obesity, insulin resistance, inflammation, endothelial damage and oxidative stress. This finding supports the role of oxidative stress in the pathogenesis of obesity and its derived metabolic complications.
Limitations of the study Although our population under study was considerably big, a larger group of subjects would have added strength to the observed findings. We did not validate our findings in a different population. The majority of the observed SNPs do not have a clear effect on genetic regulation or in the coded protein, indicating that they are most probably marker SNPs and not causative SNPs. The observed associations failed to remain significant after multiple testing Bonferroni analysis.
¿ Bibliografía Bondia-Pons I, Ryan L and Martinez JA. Oxidative stress and inflammation interactions in human obesity. J Physiol Biochem 2012; 68: 701-711.
Da Costa, L.A., Badawi, A. and El-Sohemy, A. (2012) Nutrigenetics and modulation of oxidative stress. Ann Nutr Metab 2012; 60: 27-36.
Dubois L, Ohm Kyvik K, Girard M, Tatone-Tokuda F, Pérusse D, Hjelmborg J, Skytthe A, Rasmussen F, Wright MJ, Lichtenstein P, Martin NG. Genetic and environmental contributions to weight, height, and BMI from birth to 19 years of age: an international study of over 12,000 twin pairs. PLoS One 2012; 7: e30153.
Elks CE, Loos RJ, Hardy R, Wills AK, Wong A, Wareham NJ, Kuh D, Ong KK. Adult obesity susceptibility variants are associated with greater childhood weight gain and a faster tempo of growth: the 1946 British Birth Cohort Study. Am J Clin Nutr 2012; 95: 1150-1156.
Fernández-Sánchez A, Madrigal-Santillán E, Bautista M, Esquivel-Soto J, Morales-González A, Esquivel-Chirino C, Durante-Montiel I, Sánchez-Rivera G, Valadez-Vega C, Morales-González JA. Inflammation, Oxidative Stress, and Obesity. Int J Mol Sci 2011; 12: 3117-3132.
Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, Iwaki M, Yamada Y, Nakajima Y, Nakayama O, Makishima M, Matsuda M and Shimomura I. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest 2004; 114: 1752-1761.
Gupta N, Goel K, Shah P, Misra A. Childhood obesity in developing countries. Epidemiology, determinants, and prevention. Endocr Rev 2012; 33: 48-70.
Han JC, Lawlor DA, Kimm SY. Childhood obesity. Lancet 2010; 375: 1737-48.
Rankinen T, Zuberi A, Chagnon YC, Weisnagel SJ, Argyropoulos G, Walts B, Pérusse L, Bouchard C. The human obesity gene map: the 2005 update. Obesity (Silver Spring) 2006; 14: 529-644.
Xia Q, Grant SF. The genetics of human obesity. Ann N Y Acad Sci 2013; 1281: 178-190.
