Procesos microbianos en biorreactores de membrana con lechos fluidificados en tratamientos de aguas residuales
- Autores: Patricia Reboleiro Rivas
- Directores de la Tesis: Jesús González López (dir. tes.), M. J. Belen Juarez Jimenez (dir. tes.), María Victoria Martínez Toledo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mª Belen Rodelas Gonzalez (presid.), José Manuel Poyatos Capilla (secret.), Massimiliano Fenice (voc.), Pilar Truchado (voc.), Miguel Ángel Caviedes Formento (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
RESUMEN Hoy en día la mejora del tratamiento biológico de las aguas residuales es un objetivo clave para conseguir una mejor calidad de los efluentes. Con ello, se logra por un lado proteger el medio ambiente y por otro la reutilización de dichas aguas. En los últimos años, una alternativa emergente para mejorar el proceso biológico del tratamiento de aguas residuales se basa en la idea de combinar el crecimiento microbiano suspendido y el crecimiento adherido. En este sentido, se han propuesto diferentes combinaciones de tecnologías basadas en los procesos de biopelícula y membranas de filtración (biorreactores de membrana híbridos). Desde un punto de vista biológico, la incorporación de los procesos de biopelícula confiere diversas ventajas a los biorreactores de membrana (MBRs), tales como una mayor actividad de la biomasa, mayor resistencia de la biomasa a sustancias tóxicas o socks de carga orgánica y mejora de los procesos de nitrificación y desnitrificación, ya que la biopelícula favorece el desarrollo de bacterias de crecimiento lento, tales como las bacterias nitrificantes. Uno de los MBRs híbridos más novedosos es el biorreactor de membrana con lecho fluidificado móvil (MBMBR), descrito como una combinación de un biorreactor con lecho móvil y la tecnología de membranas. En esencia, el MBMBR se basa en la adición de material de soporte al reactor biológico del sistema MBR. El material de soporte se mueve libremente en el birreactor y poco a poco es colonizado por la biomasa, dando lugar al desarrollo de una biopelícula. El tratamiento biológico de las aguas residuales se nutre de la actividad metabólica de los microorganismos para la transformación de sustancias tóxicas, la degradación de contaminantes orgánicos y la eliminación de nutrientes de efluentes industriales y urbanos. En particular, el proceso de biodegradación comienza con la hidrólisis de macromoléculas, llevada a cabo por las enzimas extracelulares. Este proceso es considerado como un paso limitante en la degradación de la materia orgánica, ya que una importante fracción de la materia orgánica presente en el influente debe ser hidrolizada por enzimas antes de que ésta pueda ser utilizada metabólicamente por las bacterias. En consecuencia, la investigación de las enzimas extracelulares así como el estudio de la estructura y dinámica de las comunidades microbianas son considerados esenciales para entender los factores ambientales/operacionales que afectan a la eficiencia y estabilidad del proceso de depuración biológica, así como para desarrollar estrategias para mejorar la eliminación de contaminantes orgánicos y nutrientes.
En este contexto, esta investigación se ha basado en la caracterización microbiológica de la biomasa suspendida (BS) y la biopelícula adherida (BA) desarrollada en un MBMBR, así como en el establecimiento de una adecuada correlación entre los parámetros operacionales y los datos biológicos. Los objetivos específicos de la presente Tesis Doctoral fueron: el análisis de las actividades enzimáticas hidrolíticas de los microorganismos (fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina y ¿-glucosidasa), el estudio de la estructura y dinámica de la comunidad bacteriana total y las AOB (bacterias oxidadoras de amonio), y el estudio cuantitativo de las bacterias degradadoras de compuestos nitrogenados. Con objeto de establecer una relación entre las condiciones operacionales y los datos biológicos, se realizaron cuatro fases experimentales con un porcentaje de relleno (CFR) del 20% y del 35% (v/v), combinando dos concentraciones de sólidos en suspensión totales en el licor mezcla (STLM) ( 2.500 y 4.500 mg/L) y dos tiempos de retención hidráulico (TRH) (10 y 24h).
Independientemente de las condiciones operacionales, las actividades hidrolíticas (fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina y ¿-glucosidasa) fueron mayores en la biomasa suspendida que en la biopelícula adherida, posiblemente debido a una mayor difusión del sustrato en el licor mezcla. Se realizó un análisis de redundancia (RDA) con objeto de evaluar la relación entre las actividades enzimáticas y los parámetros operacionales: Demanda Química de Oxígeno (DQO), Demanda Biológica de Oxígeno (DBO5), Sólidos Volátiles en suspensión del Licor Mezcla (SVLM), Sólidos Totales de la Biopelícula (STB), Tiempo de Retención Hidráulica (TRH), pH, porcentaje de relleno (CFR) y temperatura. De acuerdo con los resultados obtenidos con el test de permutación de Monte Carlo, las condiciones de operación CFR, SVLM, STB y COD de nuestro sistema contribuyeron de forma significativa en la variación de las actividades enzimáticas en el MBMBR.
Con objeto de acercarnos al conocimiento de la estructura y dinámica de la comunidad bacteriana total y de las bacterias oxidadoras de amonio (AOB), se utilizaron las metodologías de TGGE y Pirosecuenciación 454. Con el uso de estas técnicas moleculares se desveló que las estructuras de ambas poblaciones bacterianas (las totales y las AOB) eran similares tanto en la biomasa suspendida como en la biopelícula adherida. Esto podría estar relacionado con el movimiento libre y continuo de los soportes dentro del biorreactor, favoreciendo de este modo, las interacciones entre ambas fracciones (BS y BA). Otra de las posibles hipótesis podría estar basada en el tiempo de residencia de los soportes dentro del biorreactor. Para lograr una mayor comprensión de los principios ecológicos que caracterizan la comunidad microbiana se calcularon diferentes índices teóricos de riqueza, organización funcional, dinámica y diversidad en la comunidad bacteriana total y las AOB. Estos índices describieron un alto grado de diversidad y una óptima organización funcional de la comunidad bacteriana total. Por el contrario, las poblaciones de AOB se caracterizaron como más especializadas y probablemente más frágiles frente a cambios en las condiciones ambientales/operacionales. El uso de las técnicas moleculares TGGE y Pirosecuencación 454 demostraró que los filos predominantes en ambos tipos de muestras (BS y BA) y en todos los experimentos fueron Proteobacteria (clases ¿ y ß Proteobacteria) y Actinobacteria (clases Acidimicrobiia y Actinobacteria), seguido de Bacterioidetes, Chloroflexi y Firmicutes. En cuanto a la composición taxonómica de las poblaciones bacterianas oxidadoras de amonio (clase ß-proteobacterias), las bandas secuenciadas de TGGE se relacionaron filogenéticamente con el género Nitrosomonas (N. oligotropha/ureae, N. cryotolerans y N. europea). De igual modo se detectaron mediante Pirosecuenciación 454 diversos miembros relacionados con la familia Nitrosomonadaceae (del orden Nitrosomonadales) aunque no se pudieron clasificar a nivel de género. El análisis estadístico multivariante indicó que los cambios en SVLM, STB, temperatura, CFR y BOD5 afectaban directamente a la estructura y la dinámica de la comunidad bacteriana total y de las AOB en ambos tipos de muestra (BS y BA).
Por último, se evaluó mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) la abundancia de los genes diana de bacterias totales (16s rRNA), bacterias oxidadoras de amonio (16s rRNA y amoA de AOB), bacterias oxidadoras de nitrito (16s rRNA de Nitrospira, NOB) y bacterias desnitrificantes (nosZ). Los resultados obtenidos mostraron que la abundancia y dinámica de bacterias totales, AOB, NOB y desnitrificantes fueron bastante similares en ambas fracciones (BS y BA), sugiriendo que la biomasa suspendida y la biopelícula adherida podrían jugar un papel igual de importante en el proceso de nitrificación y desnitrificación en el MBMBR. El análisis RDA y el test de permutación de Monte Carlo confirmaron un efecto significativo de VSLM, STB, DQO, temperatura y CFR en los valores de abundancia de bacterias totales, AOB, NOB y desnitrificantes en ambos tipos de muestras (BS y BA).
- English
ABSTRACT Nowadays, there is certainly no doubt that improving of biological wastewater treatments is a key goal to get better quality of the effluents, which not only contribute to protect the environment, but also to enable their reuse. In recent years, the idea of combining suspended and attached growth to improve biological process on well established wastewater treatment technologies represents an interesting solution. In this sense, different combinations of biofilm-based and membrane filtration technologies (hybrid membrane bioreactors) have been proposed. From a biological point of view, the incorporation of biofilm process confers several advantages to the membrane bioreactor system (MBR) such as higher biomass activity, higher biomass resistance to toxic or organics loads socks and improving of nitrification and denitrification processes, since the biofilm favours the development of slow growing bacteria, such as nitrifying bacteria. One of the most innovative hybrid MBRs systems is the moving bed membrane bioreactor (MBMBR) described as a combination of the moving bed biofilm rector (MBBR) and the membrane technology. In essence, MBMBRs systems are based on the addition of freely moving support material (carriers) to the biological reactor of MBRs. Biofilm development takes place in the carriers.
The biological wastewater treatments feed on the metabolic activity of microorganisms for the transformation of toxic substances, the degradation of organic pollutants and the removal of nutrients from urban and industrial effluents. In particular, the biodegradation process begins with the hydrolysis of macromolecules performed by extracellular microbial enzymes. This initial process is considered as the main rate-limiting step in organic matter degradation, since an important fraction of organic matter, present in the influent, must be hydrolysed by enzymes before it can be utilised by bacterial metabolism. Consequently, it is generally accepted that the investigation of extracellular hydrolases, as well as the study of structure and dynamics of microbial communities are essential to understand the environmental or operational factors affecting efficiency and stability of the biological process, as well as to develop strategies to improve the performance of removing organic contaminants and nutrients.
In this context, this research has focussed on the microbiology characterization of the suspended biomass (SB) and attached biofilm (AB) developed in a moving bed membrane bioreactor (MBMBR) as well as on the establishment of an adequate link between operational parameters and biological data. Specifically, the analysis of microbial hydrolytic enzymatic activities (acid phosphatase, alkaline phosphatase and ¿-glucosidase), the study of structure and dynamic of total Bacteria and AOB (ammonia-oxidizing bacteria) communities, and the quantitative study of N-cycle bacteria were the goals of the research. In order to establish a rough link between operational conditions and biological data, four experimental phases with 20% and 35% (v/v) Carrier Filling Ratios (CFRs) were conducted, which combined two Mixed Liquor Total Suspended Solid (MLTSS) concentrations (c.a. 2,500 and 4,500 mg/L) and two Hydraulic Retention Times (HRTs) (10 and 24 h).
Regardless of the operational conditions, hydrolytic activities (acid phosphatase, alkaline phosphatase and ¿-glucosidase) in the mixed liquor (suspended biomass) were higher than in the biofilm under all the experimental conditions tested, it was possibly due to better substrate diffusion in the mixed liquor. A redundancy analysis (RDA) was performed to evaluate the relationship between enzymatic activities and operational parameters: Chemical Oxygen Demand (COD), Biological Oxygen Demand at 5 days (BOD5), Mixed Liquor Volatile Suspended Solid concentration (MLVSS), Biofilm Total Solids (BTS), HRT, pH, CFR and temperature. According to the results obtained with the Monte Carlo permutation test, CFR, MLVSS, BTS, COD, temperature and HRT significantly contributed to the variation of enzymatic activities in the MBMBR.
Fingerprinting and next generation sequencing methodologies (TGGE and 454-pyrosequencing, respectively), were used to approach the study of the structure and dynamic of total Bacteria and ammonia-oxidizing bacteria (AOB) communities. These molecular techniques revealed that the structure of both total Bacteria and AOB communities was greatly similar in both SB and AB samples under all the experimental conditions tested. This fact could be connected with the free and continuous movement of carriers inside bioreactor, which could favour interactions between both SB and AB fractions. Another hypothesis was based on the residence time of carriers inside bioreactor.
For better understanding about population richness and evenness in the samples, several theoretical indices (richness, functional organization, dynamics and diversity) were calculated for total Bactria and AOB communities. These indices described a total Bacteria community characterized by a high degree of diversity and optimal functional organization. By contrast, AOB community was characterized as more specialized and probably more fragile to environmental/operational conditions changes. TGGE bands sequencing and 454-pyrosequencing, showed that Proteobacteria and Actinobacteria were the predominant phyla in both sample types (SB and AB), followed by Bacterioidetes, Chloroflexi and Firmicutes. Within the phylum Proteobacteria, ¿- and ß- proteobacteria were the most predominant classes. Acidimicrobiia and Actinobacteria were the predominant classes related to phylum Actinobacteria. As for taxonomic composition of AOB community, all the TGGE-bands sequenced and belong to ammonium oxidizing ß-proteobacteria, were related to genus Nitrosomonas (N. oligotropha/ureae, N. Cryotolerans and N. europaea). The order Nitrosomonadales and the family Nitrosomonadaceae were detected by 454-pyrosequencing, but the members related to this family were unclassified at genus level. Multivariate analysis indicated that the structure and dynamic of total Bacteria and AOB communities in both SB and AB samples were mainly affected by changes in MLVSS, BTS, temperature, CFR and BOD5.
The abundance of target genes of total Bacteria (16S rRNA), ammonia-oxidizing bacteria (16S rRNA and amoA of AOB), nitrite-oxidizing bacteria (16S rRNA of Nitrospira, NOB) and denitrifying bacteria (nosZ) was evaluated by quantitative real-time PCR (qPCR). The results obtained showed that the abundance and dynamics of total Bacteria, AOB, NOB and denitrifiers were fairly similar in both SB and AB fractions, suggesting that SB and AB could play equally important roles in the nitrification-denitrification process in the MBMBR. RDA analysis and Monte Carlo permutation test confirmed a significant effect of MLVSS, BTS, COD, temperature and CFR on the abundance values of total Bacteria, AOB, NOB and denitrifiers in both samples (SB and AB).
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