Resumen de Color and nanomaterials in optical sensors
TESEO INTRODUCCIÓN El análisis simultáneo de muestras complejas es uno de los retos aún no resueltos de la Química Analítica y se trata de una de las cuestiones que suscitan gran interés en el campo de los sensores químicos. De las diversas aproximaciones usadas para sistemas multianalito, los sensores son una de las más prometedoras. Un tipo de sensores de gran interés son los de un solo uso por las ventajas que presentan (corto tiempo de análisis, facilidad de uso, bajo precio, resultados in situ, sin personal experto, no necesidad de almacenar, conservar y transportar muestras, ausencia de residuos). Se definen como dispositivos analíticos autocontenidos, pues todos los reactivos necesarios están incorporados y responden al analito mediante una reacción (bio)química 1.
Hay dos aproximaciones para la determinación multianalito mediante sensores de un solo uso: la determinación secuencial y la simultánea. El ensayo secuencial se lleva a cabo en soportes que contienen zonas espacialmente separadas, cada una con la química necesaria para el reconocimiento selectivo para cada analito. Los ensayos secuenciales se pueden clasificar en visuales, las llamadas tiras reactivas multianalito, ópticos y eléctricos.
Los sensores visuales multianalito pueden producir información cualitativa o semicuantitativa y se basan tanto en membranas monocapa, bien de impregnación, depositadas o films, como en membranas multicapa, ordenadas de alguna forma sobre un soporte polimérico. Generalmente, en las tiras comerciales un soporte contiene entre 2 y 11 elementos indicadores. Con los sensores cualitativos el cambio o desaparición de un color proporciona la respuesta disyuntiva. Este es el caso de la varilla reactiva para atrazina y carbaril en vegetales, en la que los inmunorreactivos se disponen en líneas paralelas 2. La determinación semicuantitativa de componentes se hace mediante comparación con una carta de colores 3 y se han propuesto para ello diversos formatos 4.
Los sensores cuantitativos multianalito de un solo uso se pueden basar en la resolución espacial de diferentes analitos sobre el mismo sustrato, bien con separación mediante flujo fluido lateral o sin él, y para ello se han usado tanto propiedades ópticas como eléctricas. Un ejemplo de sensores de un solo uso sin separación es la tira reactiva multizona para la determinación simultánea de varios pesticidas tipo s-triazina en agua mediante quimioluminicencia, basada en la inmovilización de tres anticuerpos con diferente reactividad cruzada hacia las s-triazinas 5. El mismo concepto ha sido usado en un multisensor potenciométrico diferencial para pH, K(I), Na(I) y Ca(II) en sangre basado en electrodos recubiertos 6. Un ejemplo de dispositivo multianalito de un solo uso que requiere separación es un inmunosensor óptico de cuatro bandas capilares para los pesticidas mesotrion, hexaconazol, paraquat y diquat 7.
Los ensayos simultáneos se pueden clasificar en: a) ensayos con señales no selectivas y deconvolución quimiométrica. Así se han usado pequeñas diferencias en diferentes colinesterasas para la determinación de pesticidas organofosforados mediante sensores amperométricos serigrafiados con uso de redes neuronales 8;9. Similarmente, se ha propuesto un inmunoensayo quimioluminiscente en formato varilla para discriminar entre tres pesticidas s-triazina usando redes neuronales 10. Se ha presentado asimismo un sensor potenciométrico serigrafiado con 8 electrodos conteniendo biopolímeros lipídicos de baja selectividad para discriminar entre lotes de medicinas de herbolario usando PCA y DFA 11; b) ensayos con multimarcadores basados en inmunoensayos con doble analito 12;13; c) ensayos con discriminación instrumental. Utilizados principalmente con técnicas de redisolución sobre electrodos desechables serigrafiados para metales pesados, como es el caso de cinc y cobre14 o de plomo y cobre 15. En cuanto a los sistemas portátiles de tipo óptico para sensores desechables lo más habitual es la excitación óptica con un LED recogiendo la señal con un fotodetector 16. Si el conjunto sensor-soporte es translúcido, la medida se puede hacer por medida de la absorbancia a una o varias longitudes de onda 17, y si no, mediante la recogida de la reflexión difusa con lentes integradoras adecuadas 18. Recientemente, estos sistemas se han adaptado al estudio de varios analitos mediante la inclusión de matrices de LEDs, calculando cada concentración mediante técnicas de regresión multivariada 19;20, resultando en prototipos no portátiles. En todos los casos, la instrumentación desarrollada han sido prototipos de laboratorio conectados a un computador para el procesamiento. Para que este tipo de instrumentación pueda convertirse en portátil es necesario acudir a las más recientes tecnologías dentro del procesamiento de señal, como pueden ser dentro de los circuitos programables, los bloques analógicos y digitales reconfigurables dinámicamente que permiten la adaptación en tiempo real de sus características, y por tanto, del tipo de procesado que pueden hacer.
Los dispositivos de membrana basados en papel ofrecen la ventaja adicional de la preconcentración y disminución del límite de detección. Por ejemplo, se ha propuesto la disposición de los reactivos de iones metálicos en membranas de acetato/nitrato de celulosa para la discriminación de ocho iones metálicos con límites de detección de 50 nM.21 Se han descrito diferentes tipos de dispositivos basados en papel: Hossain y Brennan 22 utilizando un diseño tipo flor con canales hidrofóbicos de cera impresa y áreas de detección fabricados por inyección de tinta en la que el tallo es la zona de muestreo. Feng et al 23 presenta un diseño diferente que utiliza una matriz de membranas de 3x3 preparado con la técnica de impresión de cera y recubrimiento con los reactivos. La ubicación de una pieza de papel de filtro como matriz hace posible que los analitos pasen a través de las zonas enriquecidas con los metales. Se han empleado distintas químicas, tanto colorimétricas como luminiscentes para los dispositivos descritos. Se han utilizado reactivos colorimétricos convencionales tanto solos 21 como combinados con ensayos enzimáticos, como el caso basado en ß-galactosidasa, 22 para la discriminación de 7-8 iones metálicos. Además, se han empleado algunos reactivos luminiscentes en base a la combinación de diferentes químicas de coordinación y la inclusión de elementos móviles de papel que pueden actuar de interruptores de flujo y filtros, permitiendo separaciones para generar datos discriminatorios para la clasificación de metales. 24-26 En otros casos, la matriz se compone de una familia de reactivos que combina un receptor y un fluoróforo en la molécula para introducir diferencias sutiles y aumentar el poder discriminatorio. Los ejemplos incluyen reactivos a base de derivados de la bis(2-piridilmetil)amina como receptores y BODIPY como fluoroforo 25 o la 8-hidroxiquinolina como receptor y diferentes oligofluorenos como fluoroforos.27 En general, diferentes técnicas de imagen se han utilizado para obtener las señales analíticas, desde el uso de un escaner convencional 22a un escáner de fluorescencia,25-27 una cámara CCD para medidas de tiempos de la vida 25,28 y cámaras digitales 23,25. Uno de los puntos débiles de estos dispositivos es la reproducibilidad de la preparación ya que la forma más común de depositar los reactivos en la zona de detección es mediante recubrimiento por caída, lo que aumenta la falta de homogeneidad de la zona de reconocimiento, la reducción de la fiabilidad del dispositivo y la precisión en determinaciones cuantitativas. Una alternativa es el uso de técnicas de impresión en la preparación de matrices colorimétricas con el fin de aumentar la reproducibilidad de la preparación, el poder discriminatorio de la matriz y la precisión en las determinaciones. El método de impresión por gota a demanda basado en la tecnología piezoeléctrica de inyección de tinta, es un sistema fiable para la producción de membranas sensoras, teniendo en cuenta el bajo volumen de tinta química requerida, la inyección de tinta piezoeléctrica desechable utilizado y el bajo costo de la matriz.
En la actualidad hay un alto interés por el desarrollo de nuevos materiales, con diseños de síntesis de bajo coste y química verde para la determinación de iones metálicos u otros analitos.29 Las nanopartículas fluorescentes como los quantum dots han cobrado una gran importancia durante la última década en aplicaciones de detección y bioimagen. En la actualidad, se está haciendo un gran esfuerzo por desarrollar metodologías verdes que permitan la síntesis de nuevo nanomateriales con el fin de sustituir los compuestos tóxicos, disolventes orgánicos, costes actuales y procesos que consumen tiempo. Recientemente, las nuevas nanopartículas llamadas carbón dots (cdots) han despertado un creciente interés en el campo de la química analítica y bioanalítica. Los cdots exhiben excelentes propiedades fluorescentes con alta fotoestabilidad, alto rendimiento cuántico, solubilidad en agua y biocompatibilidad. Ofrecen una síntesis simple y rentable con un método respetuoso con el medio ambiente.
Otras nanoestructutras de interés son las estructuras tipo cristal fotónico que aparecieron en la naturaleza hace varios cientos de millones de años, por ejemplo las producidas en insectos, arañas, pájaros, peces y otros animales marinos, plantas, como estrategia para la supervivencia y reproducción. Estos materiales se pueden considerar como resultantes de la ordenación periódica de materiales con diferentes constantes dieléctricas. Una estructura muy interesante y prometedora es la del silicio poroso. En los años 50, Arthur Ulhir en el Bell Labs descubrió el silicio poroso. Este material no cobró importancia hasta los años 90, cuando Leigh Canham observó que el material emitía luz visible a temperatura ambiente, lo cual provocó un reinicio de su interés durante un tiempo aunque a mediados de los 90, dada la baja eficiencia de electroluminiscencia del material se perdió un poco el interés en esta propiedad aunque se reforzó en otras propiedades características del material. A partir de la anodización del silicio monocristalino se obtiene el silicio poroso. Con un tamaño aproximado de poro de 40 nm y en función de las condiciones experimentales utilizadas (dopaje del material por átomos de otro elemento, concentración de electrolito, densidad de corriente, voltaje utilizado, temperatura) pueden lograse diferentes características de la estructura porosa, y según el tamaño de los poros mostrara propiedades morfológicas, electrónicas y ópticas singulares. La posición de la máxima longitud de onda del pico de reflectancia de un cristal fotónico a base de silicio poroso puede ser indicativo de la degradación debido a la oxidación y disolución de la matriz de silicio en medios acuosos. El silicio poroso tiene aplicaciones potenciales para la administración de fármacos, ya que es un material biocompatible y biodegradable. Además, los picos en su espectro de reflectancia se pueden sintonizar al caer dentro de la región del infrarrojo cercano del espectro electromagnético, lo que permite la monitorización directa a través de tejidos.30-32 OBJETIVOS El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es el desarrollo y preparación de matrices de sensores colorimétricos de un solo uso para su empleo como lenguas ópticas para la identificación y determinación multianalito de iones metálicos de interés biológico en control ambiental, farmacéutico y alimentario; así como la preparación y caracterización de nanomateriales con finalidad sensora.
Para lograrlo, se plantearon una serie de objetivos específicos a cumplir, como fueron el de desarrollar membranas sensoras para iones metálicos y aniones incluyendo químicas de reconocimiento de baja selectividad y suficiente sensibilidad. Así mismo se pretendió la caracterización óptica de las membranas, modelizando la respuesta frente a posibles metales diana con la finalidad de evaluar el potencial de las membranas como sensores para iones metálicos, validando y aplicando los procedimientos establecidos. Seguidamente se propuso el diseño e implementación portátil que permitiera la determinación in situ y simultanea de diversos analitos basado en cambios de color experimentado por las membranas cuando están en presencia del analito o analitos. Posteriormente se extendió la capacidad de discriminación del procedimiento, aumentando el número de membranas sensoras con químicas de reconocimiento diferentes y mejorando la reproducibilidad en la preparación de las membranas. Se llevó a cabo la puesta a punto de la preparación de matrices de sensores mediante impresión por chorro de tinta, lo que exigió la preparación de las tintas de impresión, elección de soportes y optimización de las condiciones de impresión. Para ello se establecieron procedimientos tipo lengua óptica basados en las matrices de sensores antes preparadas para identificar y determinar iones metálicos basados en la recogida de señal por técnicas de imagen y tratamiento de los datos de color mediante reconocimiento de patrones y/o análisis multivariado.
Se propuso un estudio con nuevos materiales aplicando diferentes rutas y procedimientos de síntesis de nanopartículas tipo carbon dots; así mismo se planteó la caracterización y evaluación de su potencial como sensores ópticos aplicados a muestras biológicas.
Continuando con el estudio y desarrollo de nuevos materiales, se propuso la preparación y caracterización de silicio poroso nanoestructurado con el fin de realizar el estudio de degradación de dichos materiales en disoluciones acuosas a través del cambio cromático, mediante las coordenadas RGB y HSV que experimentan como cristales fotónicos. Se planteó la comparación de dichos resultados con los ofrecidos por la técnica habitual espectroscópica, ofreciendo la posibilidad de utilizar instrumentación de bajo coste como puede ser la utilización de teléfonos inteligentes para aplicaciones en teledetección o suministro de fármacos mediante liberación controlada.
DESARROLLO EXPERIMENTAL Y DISCUSIÓN En el capítulo I se describe el diseño, preparación, desarrollo y caracterización de matrices de sensores ópticos de un solo uso multianalito de tipo lengua óptica para iones metálicos para su empleo en control de calidad en aguas y en calidad de medicamentos. Para ello, se han preparado un conjunto de fases sensoras de baja selectividad para diversos aniones metálicos basadas en reactivos cromogénicos convencionales (PAN, PAR, zincon, difenilcarbacida, cadión, ditizona entre otros) dispuestas sobre un mismo soporte, susceptibles de ser medidas mediante la instrumentación portátil. En la actualidad existe necesidad, y hay un mercado potencial, de instrumentación portátil para la determinación in situ y simultánea de diversos analitos. Se ha llevado a cabo el diseño, síntesis y evaluación de químicas de reconocimiento de baja selectividad y suficiente sensibilidad para la determinación de los analitos seleccionados, caracterizando su comportamiento frente a iones metálicos mediante espectrofotometría así como mediante la medida de color usando diversos sistemas de imagen como escáneres y cámaras fotográficas digitales. En el caso de color se ha usado como parámetro analítico los espacios de color RGB y HSV, comprobando que la coordenada tonal del espacio HSV es la que muestra mejores prestaciones. Se ha comprobado la validez de las membranas con propósitos analíticos para la resolución de mezclas de Zn(II), Cu(II), Ni(II), Fe(II) y Fe(III) en control de calidad de productos farmacéuticos utilizando regresión lineal multicomponente así como redes neuronales. Diseño y evaluación de nueva instrumentación portátil para la medida de matrices de sensores tipo lengua óptica. Aplicación y validación en muestras reales del dispositivo y sensores de un solo uso puestos a punto. Se ha llevado a cabo una implementación con instrumentación portátil y para ello se ha contado con la colaboración del Dpto. de Electrónica y Tecnología Computacional de la Universidad de Granada. Se presenta el desarrollo de un prototipo de instrumento portátil con el fin de determinar metales pesados usando una matriz de 8 sensores. Para la captura de imágenes se utiliza una µ-cámara CCD a color programable y una pantalla táctil para la presentación de las imágenes y la selección manual de la zona a analizar. Se ha realizado el procesamiento de la imagen en el propio instrumento, presentando finalmente la concentración en la pantalla LCD del mismo.
El capítulo II se centra en una mejora de la precisión de los sensores desarrollados con la utilización de una novedoso técnica de preparación de membranas sensoras, impresión por chorro de tinta. Para llevar a cabo dicha técnica se han preparado tintas sensoras conteniendo las químicas de reconocimiento incorporadas obteniendo membranas y matrices de membranas aptas para ser impresas. Para ello, se han modificado las formulaciones de las tintas a los requerimientos de la impresora. Tras ensayar diversos tipos de soportes para la impresión por chorro de tinta se han preparado hasta el momento matrices 8 membranas diferentes con 5 réplicas para evaluar la presencia de 11 metales pesados. Un estudio de la reproducibilidad de la fabricación ha mostrado una alta precisión en comparación con las técnicas de impresión anteriores (promedio de error de precisión 0,81%). La adquisición de las imágenes antes y después de la reacción de las membranas con las disoluciones conteniendo metales se realizo con una cámara fotográfica convencional y un sistema de iluminación estándar utilizando una caja de luz con un material de madera blanco, ofreciendo la posibilidad de la realización de dicho procedimiento con teléfonos inteligentes. Para evaluar el cambio de color de las membranas se utilizó como parámetro analítico el cambio tonal de la coordenada H del espacio de color HSV. Se utilizaron tratamientos mediante reconocimiento de patrones y/o análisis multivariado de clasificación y cuantificación de iones metálicos, basados en redes neuronales artificiales. La etapa de la clasificación para 13 metales, se alcanzó un éxito mínimo de 98,1%, con un umbral mínimo de 10-5 M. En esta etapa 10 de los iones de metal 13 se puede determinar con ningún error, siendo los de error siempre falsos negativos para aquellos metales que no se pueden distinguir completamente. En la segunda etapa, se estudió la estimación de la concentración de cada metal en la disolución. Se seleccionaron las mezclas de hasta 5 metales Zn (II), Cu (II), Ni (II), Cd (II) y Co (II)), siendo la precisión media producida en todos los casos es inferior a la unidad con respecto a la concentración presente. Posteriormente el capítulo se centra en la síntesis y preparación de un complejante de metales para la determinación selectiva de sulfuro en medios acuosos a pH fisiológico. El estudio se ha basado en la preparación de una membrana por impresión de tinta de un complejo formado por cobre (II) y el colorante azoico 1-(2-piridilazo)-2 naftol, (PAN-Cu) sobre un soporte de nylon, dando lugar a una membrana sensora barata, estable y reproducible para la determinación de sulfuro basado en una reacción de desplazamiento rápida que tiene lugar en cuestión de minutos.
Se han modelizado las reacciones entre las membranas sensoras formadas principalmente por los reactivos PAN y PAN-Cu junto con el cobre y el sulfuro respectivamente y se han calculado las constantes de equilibrio. La presencia de sulfuro se pone de manifiesto con un cambio de color de la membrana claramente apreciable por el ojo humano, de magenta a amarillo cuando dichas membranas sensoras se pusieron en contacto con las disoluciones acuosas dopadas con sulfuro. Este cambio cromático fue usado como parámetro analítico, medido con la coordenada H del espacio de color HSV y obtenido de las imágenes recogidas con una cámara digital lo cual abre las puertas al uso de estos análisis a un amplio rango de dispositivos de imagen como podrían ser los teléfonos inteligentes. Tras llevar a cabo una puesta a punto del método, utilizando aguas dopadas artificialmente con sulfuro, posteriormente se ha aplicado a aguas minerales reales y se obtuvo una buena sensibilidad para el sulfuro presentando un límite de detección de 0.1 µM. Se realizaron diferentes procesados de datos extendiendo el rango analítico hasta tres órdenes de magnitud.
El capítulo III trata de la síntesis y caracterización de nuevas nanopartículas llamadas carbón dots, para su uso en sensores ópticos. La síntesis fue llevada a cabo a través de la pirolisis asistida por microondas de ácido cítrico en presencia de polietilenimina obteniéndose partículas con un tamaño medio de 12 nm de carga positiva debido a la presencia de aminas primarias y secundarias en la superficie de dichas nanopartículas. Estas nanopartículas presentaron propiedades fluorescentes en 450-650 nm en un amplio rango de pH (pH = 2-8), con curvas de caída que mostraban comportamiento tri-exponencial. Además, exhiben fluorescencia tipo upconversion en el intervalo de 380-550 nm cuando se excita a 850 nm. Se realizó un estudio de la influencia de 14 iones metálicos en las nanopartículas sintetizadas y se observó una intensa atenuación de la fluorescencia cuando se exponían a la presencia de Cu (II) y Fe (III). En el caso de Cu (II) se debe a la presencia de una atenuación rápida tanto estática como dinámica y en el caso de Fe (III) es debido al mecanismo de filtro interno y se puede evitar por conversión ascendente excitando a 850 nm. Se estableció un procedimiento para la determinación de Cu (II) en base a la atenuación de la fluorescencia tanto por conversión descendente como ascendente con límites de detección de 0,09 y 0,12 M, respectivamente. Se demostró la ausencia de citotoxicidad y la permeabilidad de las nanopartículas cdots en células del riñón de embriones humanos, utilizado para la detección y técnicas de imagen de Cu (II) en sistemas biológicos.
En la segunda parte de el tercer capítulo se presentó un nuevo procedimiento para la síntesis de cdots por descomposición térmica de ácido ascórbico, como fuente de carbono, en dimetilsulfóxido en un microsistema integrado de fluidos y una plataforma térmica, que permiten el control de todas las variables de la sintesis. El tamaño medio de cdots obtenido fue de 3,3 nm presentando grupos carboxílicos en la superficie de las nanopartículas. Se observó un cambio de fluorescencia en dichos cdots con la protonación y desprotonación de los grupos carboxilo de la superficie causando dopaje electrostático/carga de las nanopartículas y un cambio en el nivel de Fermi. Del mismo modo, el color de las soluciones cdots cambiaba con el pH provocando cambios electrónicos ¿-¿ * y n-¿* por llenado o vaciado de sus bandas de valencia. Con la síntesis de carbon dots, se demostró la posibilidad de detección de pequeños cambios de pH tanto por fluorimetría como por colorimetría, utilizando una cámara digital, con un amplio rango lineal (pH 3.5 a 10.2). Los carbon dots fluorescentes fueron absorbidos en la membrana celular de muestras HEK293 demostrando que no afectaba en la morfología celular y pudiendo ser usados como sensores de pH adecuados para bioimaging en los los organismos vivos.
El capítulo IV versa sobre el empleo de nuevos nanomateriales como es el silicio poroso para la monitorización de su degradación con una cámara convencional. Se han realizado diferentes procedimientos para incrementar la estabilidad de las muestras de silicio poroso fresco, tales como el recubrimiento de la superficie del material poroso con una capa de polímero (chitosan), su oxidación parcial en un horno y su oxidación y funcionalización de la superficie con metoxidimetiloctilsilano por silanización. Las muestras fueron puestas en contacto con un flujo continuo de disolución tamponada para la monitorización de su degradación. Se utilizó un sistema instrumental para realizar la medida de la degradación del silicio poroso en las cuatro muestras, a través de un espectrofotómetro y medidas de color de forma simultánea. La técnica mas común usada para evaluar las muestras de silicio poroso han sido la medida de cambios de espesor. Esta técnica se usó en este trabajo para validar el método presentado por medidas colorimétricas realizadas con una cámara convencional. Se recogieron las imágenes durante el proceso de degradación de forma continua con una cámara digital y se recogieron los datos de color y espectrofotométricos. El procesado de la señal se llevó a cabo con dos espacios de color, RGB y HSV. Se ha presentado una adecuada correlación entre las medidas de color y las espectrofotométricas, demostrando una posible alternativa de monitorización de fases sensoras a través de sistemas fuera del laboratorio con aplicaciones biomédicas.
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