Producción y caracterización de biosurfactantes obtenidos por linajes de bacillus sp. Aisladas de estaciones del tratamiento de depuración de aguas residuales y del suelo de manglar (Brasil)
- Autores: Darlane Wellen Freitas Soares
- Directores de la Tesis: Luciana Rocha Barros Gonçalves (dir. tes.), Deisi Altmajer Vaz (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Hosiberto Batista de Sant'ana (presid.), Deisi Altmajer Vaz (secret.), Ligia Raquel Marona Rodrigues (voc.), Vania Maria Maciel Melo (voc.), Juliana Rabelo de Sousa (voc.)
- Programa de doctorado: Programa Oficial de Doctorado en Química
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
- español
RESUMEN Los biosurfactantes son sustancias de origen microbiano que poseen actividad superficial. Un grupo de biosurfactantes especialmente eficaces son los lipopéptidos, entre los que destaca la surfactina, que son producidos por bacterias del género Bacillus mediante la transformación de sustratos renovables. Dichos tensioactivos presentan un gran número de ventajas cuando se los compara con los tensioactivos sintéticos tradicionales.
En el presente estudio se investigó la producción de biosurfactantes, y en particular la de surfactina, mediante procesos fermentativos con diferentes cepas de Bacillus. Para ello se utilizaron medios de cultivo de diferente procedencia (naturales y sintéticos), habiéndose dado especial atención al empleo de fuentes de carbono residuales, como son los residuos del procesado del anacardo, y en concreto de la producción de zumo del fruto del anacardo clarificado (¿cajuína¿). El uso de fuentes de carbono no convencionales se justifica debido a la necesidad de reducir los costos de producción de los biosurfactantes, ya que en la actualidad la producción a gran escala de biosurfactantes resulta todavía poco atractiva económicamente. Por otra parte, el uso de subproductos de la industria del anacardo resulta una alternativa muy interesante, ya que en Brasil, y concretamente en el estado de Ceará, se generan elevados volúmenes de estos subproductos. Además los biosurfactantes producidos fueron posteriormente estudiados desde el punto de vista estructural y de sus propiedades interfaciales.
Tal y como se ha indicado, en las fermentaciones se emplearon diferentes cepas de Bacillus (todas ellas aisladas en Brasil), de las cuales se destaca la cepa denominada ICA56, aislada de suelo de manglar (Manglar de Icapuí, Brasil). Desde este punto de vista el trabajo se desarrolló en dos etapas:
1. Etapa1. Se estudió la producción y caracterización de biosurfactantes mediante diferentes cepas (B. subtilis LAMI005, Jag 248, Jag 249, ICA 24, ICA 56) y medios de cultivo.
2. Etapa 2. En ella se desarrollaron estudios exhaustivos con la cepa denominada ICA56, en los que el biosurfactante producido ha sido caracterizado en cuanto a sus propiedades interfaciales (tensión superficial, tensión interfacial, concentración micelar crítica o CMC, y ángulo de contacto), capacidad emulsionante y estructura química. Asimismo, también se estudió la compatibilidad ambiental del producto mediante ensayos de biodegradabilidad y toxicidad. Finalmente se desarrollaron ensayos de remediación de suelos contaminados con aceite lubricante con la finalidad de evaluar el potencial de uso del biosurfactante en la recuperación de suelos contaminados con hidrocarburos.
Cómo principales resultados de la Etapa 1, se destaca que, en las condiciones experimentales adoptadas, el microorganismo Bacillus subtilis LAMI005 fue capaz de producir biosurfactante, llegando a alcanzar valores de concentración de 225 mg/L (pH 6.0) y 275 mg /L (pH 7.0) en el medio de cultivo (Anexo A). Bajo todas las condiciones estudiadas, la producción de biosurfactante vino acompañada de una reducción de la tensión superficial del medio líquido hasta valores de 28,3± 0,3 mN/m. Además, el microorganismo demostró poseer capacidad para emulsionar diversos hidrocarburos (aceite de soja, queroseno y n-hexadecano) con un valor de índice de emulsificación (IE24) superior al 60%. Los análisis estructurales realizados, en concreto los espectros vibracionales obtenidos en la región del infrarrojo (FTIR), confirman que el biosurfactante producido pertenece a la clase de los lipopéptidos. Por otra parte, también se verificó que el microorganismo denominado Bacillus sp. Jag248 presenta una clara producción de surfactina, alcanzando valores de concentración de hasta 161.41 ± 0.01 mg/L en medio mineral; dicha producción fue acompañada de una reducción de la tensión superficial hasta los 28.50 mN/m. El biosurfactante producido fue capaz de emulsionar aceite de soja, n-hexadecano y queroseno, presentando valores de IE24 de 50%. En lo que se refiere al Bacillus sp. Jag249, se ha verificado que, en las condiciones experimentales adoptadas, no fue capaz de producir biosurfactantes. En cuanto a las cepas ICA24 e ICA56, se llegó a la conclusión de que las mismas son capaces de producir biosurfactantes, y por lo tanto, reducir significativamente la tensión superficial de los medios de cultivo (valores finales de aproximadamente 28.25 ± 0.4 mN/m). Entre las cepas estudiadas, la que permitió alcanzar una mayor concentración de biosurfactante en un medio mineral adicionado de solución de micronutrientes e inóculo LB Broth fue la ICA56 (329.14 ± 0.00 mg/L) seguida de la cepa ICA24 (111.87 ± 0.00 mg/L, medio adicionado con jugo de anacardo clarificado).
Las propiedades interfaciales determinadas en la etapa 2, tensión superficial (28.20 ± 0.07 mN/m), tensión interfacial (5.26 ± 0.08 mN/m a 65 ºC, para una concentración de 60 mg/L), y CMC, están de acuerdo con la literatura. Adicionalmente, se verificó que los valores de tensión superficial y tensión interfacial disminuyen con el aumento de temperatura (intervalo 25 ¿ 65°C). Mediante análisis de Espectroscopía Infrarroja (FTIR) y Espectrometría de Masas (MS) se identificó al biosurfactante producido por ICA56 como surfactina. Se investigó también la producción simultánea de biosurfactantes y enzimas por el microorganismo ICA56, constatándose la presencia de amilasas y proteasas en el medio de fermentación al final del proceso. En lo que se refiere a los ensayos de toxicidad, el biosurfactante presentó una baja toxicidad para diferentes organismos, cómo son las microalgas (Selenastrum capricornutum), microcrustáceos (Daphnia magna) y la bacteria Vibrio fischeri, presentando valores de EC50 de 65.03 mg/L, 170.09 mg/Ly 912.35 mg/L, respectivamente. El biosurfactante producido por ICA56 presentó también una alta biodegradabilidad, siendo degradado tanto por bacterias presentes en aguas residuales urbanas (población mixta y aireada) cómo por Pseudomonas putida.
Por último los ensayos de lavado de suelos contaminados con aceites lubricantes permitieron estudiar el efecto de la temperatura y de la concentración del biosurfactante producido por ICA56 sobre la eficacia de lavado. Mediante técnicas estadísticas, se comprobó la significancia de ambos parámetros. Los mejores resultados de lavado (85% de eficacia) se obtuvieron a 65 ºC, para una concentración de biosurfactante de 60 mg/L. En ensayos cualitativos también se verificó que el microorganismo ICA56 es capaz de degradar de forma eficiente petróleo y mezclas de aceite de girasol e oliva (tanto virgen como usado), lo que sugiere la posibilidad de su uso para fines de biorremediación.
Palabras clave: Bacillus sp.; producción de biosurfactantes; surfactina, remediación de suelos, biodegradabilidad; toxicidad
- English
ABSTRACT Biosurfactants are molecules of microbial origin that have superficial action. Among the most effective are the lipopeptide biosurfactants produced by bacteria of the genus Bacillus, especially surfactin. The biosurfactants have a number of advantages compared to conventional chemical surfactants, such as diversity of chemical structures and ecological excellent surface properties, stability in extreme conditions (pH, temperature, salt concentration), among others. In this context, is developed this work, whose main objective was to investigate the production of biosurfactants, surfactin in particular, from the submerged fermentation using different culture media (synthetic and natural) and different micro-organisms of the genus Bacillus, which were isolated from a wastewater treatment station (UFC - Pici) and mangrove soil. Among the culture media tested, the use of synthetic media and clarified cashew juice, unconventional substrate from those of the cashew processing industries, were evaluated. The use of cashew apple juice clarification is justified by the fact that its production chain generates significant volumes of co-products in the industry often wasted. Among the different strains of Bacillus tested for the production of biosurfactants, stood out the strain ICA56, isolated from soil of mangrove Icapuí (Ceará - Brazil). Qualitative tests indicated consumption capacity of oil and mixtures of sunflower and olive (both virgin and used) by micro-organism ICA56 oil. The interfacial properties, emulsifying capacity and chemical structure of biosurfactant produced by ICA56 were studied. The biosurfactant stability against temperature, pH and NaCl concentration was also evaluated. The values of surface tension (28.20 ± 0.07 mN/m), interfacial tension (5.26 ± 0.08 mN/m to 25 ºC at a concentration of 60 mg/L) and critical micelle concentration (0.0173 ± 0.001 g/L, 25 ºC) found in this work are in agreement with previous studies by other researchers. The biosurfactant produced by ICA56 was identified as a lipopeptide type, by Spectroscopy Mass (MS) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), since the spectra obtained showed similar profiles of those of a surfactin standard (Sigma Aldrich). Remediation assays of a soil contaminated with engine oil have also been performed in order to study the potential of biosurfactant for environmental applications. The biosurfactant produced by ICA 56 was able to remove 85.01% of lubricant oil adsorbed in tests performed at 65 ºC with a biosurfactant concentration of 60 mg/L. The literature reports that biosurfactants are less toxic than synthetic surfactants. The environmental compatibility of the biosurfactant produced by Bacillus sp. ICA 56 was evaluated by toxicity and biodegradability tests. The biosurfactant presented low toxicity to aquatic organisms such as the microalgae Selenastrum capricornutum, the microcrustacean Daphnia magna and the bacterium Vibrio fischeri, with EC50 values of 65.03 mg/L, 170.09 g/L and 912.35 mg/L, respectively. Additionally, the biosurfactant produced by ICA56 showed high biodegradability as indicated by the results of biodegradability tests carried out with Pseudomonas putida (B50 value, i.e. 50% degradation, at 122.1 mg/L) and with an inoculum from a wastewater treatment plant (more than 50% biodegradation for all the biosurfactant concentrations studied occur within 100 hours and more than 90% within 300 hours). These results demonstrate the high environmental compatibility of the biosurfactant produced by ICA56, which makes it a potential candidate for the remediation of polluted soils.
Keywords: Strains of Bacillus sp.; production of biosurfactants; surfactin; remediation; biodegradation; toxicity.
- español
