Establecimiento del papel del uracilo en la integridad genómica y la infectividad en trypanosoma brucei
- Autores: Fernando Aguilar Pereyra
- Directores de la Tesis: Dolores González Pacanowska (dir. tes.), Víctor Castillo (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carmen Marco de la Calle (presid.), Juana Pérez Torres (secret.), Agustín Benito Llanes (voc.), Miguel Angel Navarro (voc.), Núria Gironés Pujol (voc.)
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- Resumen
Establecimiento del papel del uracilo en la integridad genómica y la infectividad en Trypanosoma brucei.
Las enfermedades protozoarias constituyen en la actualidad un importante problema de salud pública a nivel mundial. Trypanosoma brucei es el agente causante de la enfermedad del sueño y constituye un paradigma en el estudio de la biología y parásitos protozoos de la familia Trypanosomatidae. A pesar de la elevada incidencia e impacto socio-económico de estas enfermedades, el número de fármacos disponibles para el tratamiento es reducido y existen problemas de toxicidad y resistencias.
El uracilo no es un componente usual del DNA en la mayoría de los sistemas biológicos y se considera que su presencia en el DNA tiene consecuencias negativas, generando mutaciones que afectan a la integridad genética (Guillet, Van Der Kemp et al. 2006) y en última instancia produciendo la muerte celular (el-Hajj, Zhang et al. 1988). Es por ello que el control de la presencia de esta base es de vital importancia y tiene un alto interés desde un punto de vista farmacológico (Castillo-Acosta, Estevez et al. 2008; Castillo-Acosta, Aguilar-Pereyra et al. 2013).
Se han estudiado las dos enzimas de responsables del control de la presencia de uracilo en tripanosomátidos. Por un lado la desoxiuridina trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa), enzima responsable de la eliminación de dUTP del pool de nucleótidos, evitando de esta forma una incorporación masiva de uracilo al DNA como resultado de la utilización de dUTP por parte de la DNA polimerasa. Por otro lado, la enzima uracil-DNA glicosilasa (UNG), encargada de escindir el uracilo del DNA, tanto si proviene de una incorporación errónea o de la desaminación de la citosina.
Los resultados obtenidos muestran que la depleción de la dUTPasa resulta en un arresto de la proliferación y un aumento de la tasa de mutación espontánea frente a una línea parental, también se observa un aumento de roturas de cadena en el DNA provocado por la incorporación de uracilo y la posterior acción de los mecanismos de reparación del DNA. Estos datos apoyan un papel esencial de la enzima en el mantenimiento de la integridad genética y viabilidad celular, validándola como posible potencial blanco de acción de fármacos.
Por otro lado, una fuerte inhibición de la expresión de dUTPasa en ausencia de actividad UNG perjudica en gran medida la viabilidad celular tanto en la forma sanguínea como en la forma procíclica, lo que subraya la extrema sensibilidad de los tripanosomas a la presencia de uracilo en el DNA. Bajo estas condiciones ocurre una incorporación masiva de dUTP en el DNA y así como una elevada fragmentación cromosómica.
Se ha analizado también alguna otra posible actividad de escisión de uracilo mediante el uso de una línea celular knock-out para el gen de la UNG, si bien no pudimos detectar ninguna actividad de escisión en pares U: G ni U: A. Por otro lado, en estos organismos carentes de actividad UNG se detectó un mayor número de roturas de cadena de DNA, lo que sugiere la activación de las vías de reparación del alternativas. Por último, hemos comprobado que la eliminación defectuosa de uracilo a través de la vía de reparación por escisión de base da lugar a hipersensibilidad a estrés oxidativo y a una reducción de la infectividad in vivo que demuestra que una eliminación eficiente de uracilo es importante para la supervivencia del parásito en el huésped mamífero. Sorprendentemente, estos parásitos deficientes en UNG aislados después de la exposición a la respuesta inmune primaria son capaces de desarrollar una resistencia a NO y además recuperan la virulencia correspondiente a una línea parental. Esta resistencia se asocia con un aumento en la expresión de la enzima triparedoxina peroxidasa citosólica (TRYP1), una proteína de la familia de las peroxirredoxinas encargada de la reducción de H2O2, hidroperóxidos orgánicos y peroxinitritos. Se trata de un mecanismo de defensa transitorio en Trypanosoma brucei ya que se revierte tras 2 meses de mantenimiento en cultivo.
Bibliografía: - Guillet, M., P. A. Van Der Kemp, et al. (2006). "dUTPase activity is critical to maintain genetic stability in Saccharomyces cerevisiae." Nucleic Acids Res 34(7): 2056-2066.
- el-Hajj, Zhang et al. (1988). ¿Lethality of a dut (deoxyuridine triphosphatase) mutation in Escherichia coli¿. J Bacteriol. 1988 Mar; 170(3):1069-75.
- Castillo-Acosta, V. M., A. M. Estevez, et al. (2008). "Depletion of dimeric all-alpha dUTPase induces DNA strand breaks and impairs cell cycle progression in Trypanosoma brucei." Int J Biochem Cell Biol 40(12): 2901-2913.
- Castillo-Acosta, V. M., F. Aguilar-Pereyra, et al. (2013). "Pyrimidine requirements in deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase deficient Trypanosoma brucei mutants." Mol Biochem Parasitol 187(1): 9-13.
