Resumen de Intestinal anti-inflammatory activity of probiotics in experimental models of colitis: impact of cell viability and role of mirnas
RESUMEN 1. Introducción El término Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) comprende dos patologías: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Ambos cuadros clínicos se caracterizan por una inflamación crónica y recurrente del tracto gastrointestinal, de etiología desconocida, en la que se alternan periodos de exacerbación de los síntomas, seguidos de intervalos más o menos prolongados de remisión de los mismos (Baumgart & Sandborn, 2007; Fiocchi, 1998).
Aunque hasta el momento se desconocen los mecanismos responsables de la iniciación y perpetuación en el tiempo del proceso inflamatorio intestinal, es aceptado que en su fisiopatología están implicados factores genéticos, ambientales e inmunológicos. Así, numerosos estudios han propuesto que, en personas genéticamente predispuestas, una activación exagerada y descontrolada del sistema inmune intestinal frente a un determinante antigénico desconocido, puede desencadenar la aparición de la respuesta inflamatoria intestinal exacerbada (Podolsky, 2002). Esta respuesta inmunológica genera numerosos mediadores de carácter pro-inflamatorio (citocinas, eicosanoides y metabolitos reactivos derivados del oxígeno o del nitrógeno) que actúan de forma sinérgica y simultánea promoviendo la amplificación y cronificación del proceso inflamatorio intestinal (Abraham & Cho, 2009; Baugh et al., 1999; Boughton-Smith, 1994; Chin & Parkos, 2006; Sartor, 1997).
Asimismo, son numerosos los estudios que sugieren que la microbiota juega un papel clave en el inicio y desarrollo de la EII (Guarner et al., 2002). Se propone que existe un desequilibrio en las concentraciones luminales de determinadas bacterias en pacientes con EII, proceso llamado disbiosis, de forma que el incremento en la proporción de bacterias potencialmente agresivas, como Bacteroides, cepas adhesivas/invasivas de Escherichia coli, y enterococos, y la disminución de poblaciones protectoras como lactobacilos y bifidobacterias (Darfeuille-Michaud et al., 2004; Farrell & LaMont, 2002; Neut et al., 2002).
El papel que la microbiota puede desempeñar en la patogénesis de la EII ha sido reforzado por numerosas evidencias y observaciones llevadas a cabo en los últimos años. Se ha observado un incremento en el número de bacterias entéricas y sus metabolitos en la mucosa inflamada de sujetos aquejados de EII (Guarner et al., 2002; Schultsz, Van Den Berg, Ten Kate, Tytgat, & Dankert, 1999; Swidsinski, Weber, Loening-Baucke, Hale, & Lochs, 2005). Relacionado con esto, se ha observado que las zonas más frecuentemente afectadas por el proceso inflamatorio en la EII (íleon distal y colon) son las regiones del intestino con mayor carga bacteriana (Sartor, 1997). La composición de la microbiota intestinal se encuentra alterada en estos pacientes. La evidencia más contundente, deriva de modelos experimentales que muestran como el proceso inflamatorio intestinal que se desarrolla de forma espontánea en distintos animales transgénicos, no tiene lugar cuando los animales son mantenidos en condiciones libres de gérmenes (Rath et al., 1996; Sadlack et al., 1993; Taurog et al., 1994).
Por otra parte, recientemente, se ha puesto de manifiesto el papel de los micro-RNAs (miRNA) en diferentes patologías. Los miRNAs son pequeñas moléculas endógenas de ácido ribonucleico (RNA) no codificante implicados en numerosos procesos biológicos (O'Connell, Rao, & Baltimore, 2012), entre los que se incluyen la regulación del sistema inmune; debido a esto se les relaciona con la patogénesis de numerosas enfermedades, como la EII (Biton et al., 2011; Paraskevi et al., 2012; Pekow et al., 2012; Wu et al., 2008). Por otro lado, han surgido determinadas evidencias del papel de la microbiota intestinal en la regulación de la expresión de los miARNs (Dalmasso et al., 2011; Xue et al., 2011). Evidencias, sustentadas en estudios realizados en diferentes modelos de animales y en humanos, en los que se ha visto una asociación entre la modificación de la expresión de determinados miARNs y la composición y diversidad de la microbiota intestinal (Feng et al., 2012; Singh et al., 2012; Xue et al., 2011).
Por lo tanto, una estrategia terapéutica potencialmente útil en el control de estas enfermedades consistiría en restablecer el equilibrio en la microbiota del lumen intestinal, lo que podría obtenerse mediante la administración de determinados probio¿ticos (Gionchetti et al., 2006).
En base a esto, la evidencia más significativa del uso de probio¿ticos en la EII, es aquella procedente de ensayos clínicos en los que se ha evaluado la efectividad del probiótico Escherichia coli Nissle 1917 o de la mezcla de probio¿ticos VSL#3 y que muestran su utilidad como tratamientos para el mantenimiento del estado de remisión y la prevención de las recaídas (Schultz & Lindstrom, 2008)(Scott & Aberra, 2011).
Los mecanismos propuestos como responsables de los beneficios derivados de su uso en la EII incluyen: la producción de compuestos antibacterianos y la reducción del pH, acciones por las que modifican la composición de la microbiota intestinal, inhibiendo el crecimiento de bacterias nocivas; su capacidad de desplazar a estas bacterias de su sitio de unión al epitelio; la mejora de la función de barrera intestinal; y la modulación de la respuesta inmune de la mucosa del hospedador (Rioux & Fedorak, 2006). Sin embargo, no todos los probio¿ticos comparten las mismas propiedades, cada uno posee mecanismos de acción individuales, y es el estado del hospedador el que va a condicionar la elección de la especie o cepa optima (Shibolet et al., 2002).
Por lo tanto, teniendo en cuenta la etiología de la EII, y que actualmente no existe un tratamiento adecuado que combine eficacia y ausencia de efectos adversos; sería interesante desarrollar estrategias terapéuticas que corrijan la disbiosis, y que al mismo tiempo, controlen la respuesta inmune alterada que promueve el proceso inflamatorio intestinal.
Así que, se propusieron dos objetivos principales: 1) Establecer una posible relación entre la modificación de la microbiota intestinal, el perfil de la expresión de miRNAs y el desarrollo del proceso inflamatorio en dos modelos de colitis experimental.
2) Evaluar si el efecto anti-inflamatorio mostrado por los diferentes probio¿ticos está relacionado con la modificación de la microbiota intestinal; y si, la modulación de la respuesta inmune intestinal puede estar asociada con una modificación en la expresión de aquellos miRNAs que se hayan visto alterados en el proceso inflamatorio.
Por otro lado; aunque tradicionalmente, la viabilidad del probiótico ha sido requisito imprescindible para ejercer efectos beneficiosos en la EII; han aparecido, recientemente, estudios que revelan que determinados probio¿ticos podrían ejercer efectos anti-inflamatorios en diferentes modelos experimentales de colitis sin que la viabilidad sea condición indispensable. En este contexto, en esta tesis se evaluará si la viabilidad de uno de los probio¿ticos, Lactobacillus fermentum CECT5716, es esencial para ejercer su actividad en estas condiciones intestinales.
Para llevar a cabo nuestros objetivos se usaron 4 cepas de probio¿ticos diferentes: Lactobacillus fermentum CECT5716, Lactobacillus salivarius CECT5713, Escherichia coli Nissle 1917 y Saccharomyces boulardii CNCMI-745. Los probio¿ticos fueron administrados de forma oral y como tratamiento preventivo en los dos modelos de colitis experimental, en el modelo del sulfato de dextrano so¿dico (DSS) (Dextran Sulfate Sodium) y en el del ácido sulfónico dinitrobenceno (DNBS) (Dinitrobenzene Sulfonic Acid) en ratones. Durante el desarrollo de las experiencias se controlaron diariamente una serie de parámetros generales, que incluyen el consumo diario de comida de los animales, la evolución del peso corporal, y la aparición de heces diarreicas y sanguinolentas por visualización de restos perianales (Bell, Gall, & Wallace, 1995).
Tras el sacrificio de los animales, el colon fue extraído en su totalidad. El tejido colónico fue fragmentado para determinaciones bioquímicas y extracción de RNA y miRNAs. Además, se recogieron los contenidos fecales para la extracción de ácido desoxirribonucleico (DNA) bacteriano genómico en su totalidad y se realizó la amplificación del gen 16S del ARNr, concretamente la región V1-V3. Posteriormente, se llevó a cabo la secuenciación del material genético por pirosecuenciacion de los amplicones (Zhang, Luo, Fang, & Wang, 2010). Las alteraciones intestinales fueron caracterizadas en base a parámetros macroscópicos y bioquímicos, evaluando el efecto antiinflamatorio intestinal de los diferentes tratamientos administrados.
De forma adicional, los diferentes efectos inmunomoduladores directos por parte de los diferentes probio¿ticos se comprobó in vitro sobre la línea epitelial de mucosa colo¿nica (CMT-93) y en macrófagos derivados de la medula ósea (BMDM), dos tipos celulares implicados en la respuesta inmune intestinal.
Finalmente, para evaluar si es requisito indispensable la viabilidad del probiótico, Lactobacillus fermentum CECT5716, en el efecto anti-inflamatorio intestinal se llevaron a cabo estudios in vivo e in vitro. Para ello, se utilizó el modelo del ácido trinitrobencenosulfo¿nico (TNBS) en ratas. La muerte del probiótico se llevó a cabo sometiéndolo a shock térmico durante 30 minutos a 95ºC. El probiótico, tanto vivo como muerto, fue administrado oralmente durante dos semanas antes de la inducción de la colitis con TNBS y se continuó hasta completar el ensayo. Después de tres semanas, los animales fueron sacrificados y el daño macroscópico fue valorado en función de la relación peso/longitud del colon. En el modelo del TNBS se asignó el daño macroscópico (IDM) de acuerdo con el criterio descrito por Bell y col. (1995) (Bell et al., 1995). Las determinaciones bioquímicas incluyeron la valoración del estado oxidativo colo¿nico, mediante la determinación de la actividad del enzima mieloperoxidasa (MPO) (Krawisz, Sharon, & Stenson, 1984), el contenido de glutation (GSH) total (Anderson, 1985) y la expresión proteica del enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) intestinal mediante Western blot (Camuesco et al., 2004). Asimismo, se procedió al análisis de la expresión génica, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de forma cuantitativa, de distintos marcadores del proceso inflamatorio, como factor de necrosis tumoral (TNF)-¿ e interleucinas(IL)-1ß.
Finalmente, se evaluó el efecto de la viabilidad del probiótico in vitro, en dos líneas celulares implicadas en la respuesta inmune, la línea Caco-2 de adenocarcinoma humano y las RAW 264.7, macrófagos murinos. En células Caco-2, se determinó IL-8 mediante técnicas de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), mientras que la expresión proteína de p44/42 y p38 (ruta de señalización de las MAP quinasas) fue determinada por Western blot. En células RAW 264.7 se determinó el efecto del probiótico, tanto vivo como muerto, con el uso de la técnica ELISA, con la que se midió la producción de IL-1ß; y los niveles de nitritos producidos por el método de Griess (Green et al., 1982).
2. Resultados En el modelo del DSS en ratones, en el que se administraron los probióticos de forma preventiva durante 26 días, periodo tras el cual los ratones tratados experimentaron una mayor recuperación del daño intestinal (disminución del índice de actividad de la enfermedad, menor relación peso/longitud del colon), asociada a una reducción en la producción de citocinas pro-inflamatorias como IL-1ß, una disminución de la expresión de enzimas como matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9 e iNOS. Por otra parte aumentaron la expresión de proteínas de integridad de la membrana epitelial como mucinas(MUC)-2, MUC-3, occludina(OCLN) y zonula occludens (ZO)-1. Al comprobar los miRNAs alterados en ambos modelos DSS y DNBS, pudimos observar que en modelo del DSS, los ratones colíticos presentaban una expresión más elevada con respecto al sano de miR-10, miR-155 y miR-223; y una reducción de la expresión miR-143 y miR-375. Asimismo, el tratamiento con los diferentes probio¿ticos resultó, de forma general, que los probio¿ticos modifican la expresión de la mayoría de los miRNAs, aunque su actuación difiere entre ellos. Todos los probio¿ticos mostraron efectos significativos en la regulación de miR-155 y miR-223; y, solo L.fermentum y E.coli Nissle 1917 mostraron efecto en la regulación de la expresión de miR-143 y miR-150. Para evaluar la composición de la microbiota y su posible alteración en modelo de colitis y con los diferentes tratamientos realizamos la secuenciación del DNA extraído de las muestras fecales; y calculamos diferentes índices ecológicos como; índice de Shannon (parámetro que combina riqueza y uniformidad); de Pielou (muestra la presencia eventual de algún individuo además de cómo se distribuye en la muestra) y por último el índice de Chao (índice de riqueza estimada). Además, se calculó la abundancia de los principales filos bacterianos y la ratio de los dos mayoritarios, Firmicutes y Bacteriodetes. La relación Firmicutes y Bacteriodetes, conocida como F/B, es un potencial marcador para evaluar una situación de disbiosis y/o patológica (Mariat et al., 2009; Sanz & Moya-Perez, 2014; Youmans et al., 2015). Los resultados obtenidos revelaron que solo la administración de L.fermentum y E.coli Nissle 1917 fue capaz de incrementar el valor de los tres parámetros ecológicos, que se vio disminuido en los ratones colíticos. Por el contrario, el ratio F/B sufrió un drástico incremento comparado con el grupo de animales sanos. Este incremento se relacionó con una alta abundancia de Firmicutes y una reducción de abundancia de Bacteriodetes; resultado que se relaciona con estudios previos en condiciones de inflamación intestinal en humanos (Frank et al., 2007; Jeffery et al., 2012; Krogius-Kurikka, et al., 2009; Krogius-Kurikka, Lyra, et al., 2009). En este caso todos los tratamientos mostraron efecto restaurando los valores con la excepción de S.boulardii.
Una vez evaluados los efectos de los diferentes probio¿ticos en el modelo del DSS, de la misma forma procedimos a evaluarlos en el modelo del DNBS en ratón. El tratamiento de los probio¿ticos tuvo una duración total de 24 días. La inducción de la colitis con DNBS fue realizada al día 20 de tratamiento. La colitis experimental inducida fue caracterizada por una reducción progresiva de peso, asociada a reducida ingesta de comida y presencia de diarrea. Aunque no se observó diferencias significativas en las medidas anteriores por parte de los tratamientos, una vez sacrificados los animales se procedió a la determinación bioquímica y consiguiente evaluación de la microbiota. Si bien, no se observaron diferencias macroscópicas, si pudimos observar cómo el tratamiento con los probio¿ticos L.fermentum y E.coli Nissle 1917 fue capaz de disminuir la expresión de citocinas pro-inflamatorias como IL-1ß y TNF-¿, además de MMP-2. Además, todos los probio¿ticos restauraron de forma significativa la expresión de proteínas de integridad de la membrana epitelial como MUC-3 y OCLN. El proceso inflamatorio en el modelo del DNBS fue asociado con modificaciones en la expresión de miRNAs. El grupo colítico presentó un incremento en la expresión de miR-155 y miR-223 y una reducción de miR-143, miR-150 y miR-375. Los tratamientos con los diferentes probio¿ticos no mostraron el mismo perfil con respecto a estos miRNAs, con la excepción del miR-150 que fue restaurado de forma significativa por todos los probio¿ticos. Cuando la microbiota fue evaluada, los análisis de los diferentes parámetros ecológicos, mostraron que en este caso, los animales colíticos sólo presentaron una disminución de la diversidad microbiana, como puso de manifiesto la reducción del valor del índice de Shannon. Esta disminución fue restaurada por todos los probio¿ticos excepto por S.boulardii. El cálculo del ratio F/B, en el modelo del DNBS, fue disminuido de forma significativa con respecto al grupo sano y restaurado sólo por los tratamientos con L.fermentum y E.coli Nissle. Esta disminución del ratio y posterior restauración por parte de los probio¿ticos se relacionó con una disminución de la abundancia del filo Firmicutes.
Para llevar a cabo una mejor caracterización de las propiedades inmunomoduladoras de los probio¿ticos y examinar su papel en el efecto anti-inflamatorio intestinal mostrado se realizaron estudios in vitro en células CMT-93 y BMDM, determinando la expresión de diferentes marcadores implicados en la respuesta inflamatoria. En CMT-93 todos los probio¿ticos mostraron un incremento en la expresión de MUC-3; solo E.coli Nissle fue capaz de disminuir la expresión de TNF-¿ y finalmente, todos presentaron una reducción de la expresión de IL-6 con excepción de L.salivarius. Sin embargo, en BMDM, L.fermentum fue el único tratamiento que mostró una mejora de la expresión de TNF-¿, iNOS e IL-6.
Finalmente, la evaluación de la viabilidad del probiótico, L.fermentum, como requisito indispensable para ejercer efecto beneficioso, mostró in vivo que el pre-tratamiento con el probiótico, tanto vivo como muerto, redujo el daño inducido por TNBS comparado con los animales colíticos. Así, el efecto anti-inflamatorio fue demostrado por una reducción significativa de los valores del índice de daño macroscópico. Los grupos tratados con el probiótico en las diferentes condiciones, mostraron una reducción en la actividad MPO, un buen marcador de la infiltración granulocitica (Krawisz et al., 1984) que se encuentra incrementado como consecuencia del proceso inflamatorio. El estrés oxidativo fue contrarrestado igualmente por el tratamiento con el probiótico en ambas condiciones como muestra la parcial recuperación de los niveles de glutatión total, uno de los principales compuestos implicados en la respuesta antioxidante fisiológica (Grisham, 2002) que resultó disminuido en los animales colíticos sin tratamiento. Igualmente, ambas condiciones del probiótico disminuyeron TNF-¿ e IL-1ß, dos de las principales citocinas involucradas en el proceso inflamatorio (Macdonald & Monteleone, 2005; Strober & Fuss, 2011); además de reducir significativamente la expresión de la enzima iNOS, principal producto de nitric oxide (NO), mediador pro-inflamatorio que juega un papel clave en la patogénesis de la EII (Zingarelli, Szabo, & Salzman, 1999). También, se realizaron estudios in vitro en dos tipos celulares implicados en la respuesta inmune, células Caco-2 y RAW 264.7. Los resultados de la incubación del probiótico, vivo y muerto, en ambas líneas celulares resultó en una reducción de la producción de mediadores inflamatorios producidos por estas células tras ser estimuladas. Concretamente, ambas formas del probiótico, en células Caco-2, han reducido la producción de los niveles de IL-8 y de la expresión de las proteínas, p44/42 y p38 de la vía de las MAP kinasas. Asimismo, en células RAW 264.7, la incubación de ambas condiciones del probiótico disminuyó los niveles de IL-1ß y nitritos.
3. Conclusiones 1. La administración de los probio¿ticos como tratamiento preventivo ejerce un efecto anti-inflamatorio intestinal tanto en el modelo experimental de DSS como en el del DNBS en ratón. Su habilidad para modificar la composición de la microbiota y las propiedades inmunomoduladoras características de estas bacterias están implicadas en sus efectos beneficiosos. El tratamiento de los probio¿ticos muestra un impacto positivo en la respuesta inmune innata y adaptativa; además, de conseguir modificar a nivel post-transcripcional diferentes miRNAs, los cuales se han visto alterados en condiciones de estado inflamatorio intestinal.
2. Todos los probio¿ticos evaluados, al igual que otros usados en la terapia de la EII, ejercen un efecto inmunomodulador, evidenciado por su efecto in vitro en células epiteliales colónicas y macrófagos, en los cuales consiguieron restaurar la expresión de diferentes marcadores implicados en la respuesta inmune.
3. Los mecanismos implicados en los efectos anti-inflamatorios parecen ser dependientes del probiótico utilizado, ya que cada probiótico ha presentado un patrón diferente en la modulación de la expresión de los diferentes marcadores inflamatorios evaluados, así como en la modificación de la composición de la microbiota.
4. La viabilidad del probiótico L.fermentum CECT5716 no es esencial para ejercer su efecto anti-inflamatorio. Ambas condiciones, vivo y muerto, han demostrado atenuar el proceso inflamatorio en el modelo del TNBS así como in vitro. Esto podría proporcionar un valor añadido al probiótico e implicaría la revisión del generalmente aceptado concepto de probiótico.
