Resumen de Ribavirina en monoterapia previa al tratamiento combinado con interferón-alfa pegilado en pacientes con hepatitis crónica c genotipo 1 previamente no tratados: estudio de la cinética viral, niveles plasmáticos de ribavirina y mutaciones del vhc
Introducción La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) supone una de las causas principales de enfermedad hepática crónica a nivel mundial. La Ribavirina (RBV), un análogo sintético del nucleósido guanosina, ha demostrado tanto in vitro como in vivo una amplia actividad antiviral frente a virus RNA (ácido ribonucleico) y DNA (ácido desoxirrobonucleico), y desde hace más de dos décadas constituye un elemento clave en el tratamiento de la hepatitis crónica C (HCC).
Los primeros ensayos clínicos que utilizaron RBV en monoterapia en pacientes con HCC mostraron un efecto beneficioso asociado al descenso de los niveles de ALT y a una mejoría en los hallazgos histológicos de la biopsia hepática, sin embargo, estos efectos no se acompañaron de una respuesta virológica sostenida (RVS) al tratamiento antiviral. Posteriormente, se demostró que la asociación de la RBV al Interferón (IFN) estándar o pegilado (peg-INF) aumentaba significativamente la probabilidad de alcanzar la RVS frente al uso del IFN en monoterapia, consiguiendo un descenso de los eventos breakthrough virales y de la tasa de recidivas. En la actualidad, la RBV mantiene su importancia para el éxito de la triple terapia con Boceprevir o Telaprevir, e incluso, aunque se prevee un futuro cercano con pautas antivirales sin IFN, el abandono de la RBV en las próximos regímenes terapéuticos con nuevas moléculas parece más lejano.
Hasta la fecha, y pese a los esfuerzos invertidos en su conocimiento, el mecanismo de acción de la RBV frente al VHC continúa sin estar completamente establecido, y se han propuesto varias formas de actuación entre las cuales la posibilidad de su potencial mutagénico ha despertado gran interés. La hipótesis de la ¿catástrofe error¿ propone que la RBV se incorpora durante la transcripción viral introduciendo mutaciones en la secuencia de nucleótidos y causando una mutagénesis acelerada que conlleva finalmente a la extinción viral. Estudios llevados a cabo en modelos celulares de otros virus como el poliovirus o el virus de Hantaan, han evidenciado las propiedades mutagénicas de la RBV, sin embargo, los resultados in vivo en pacientes infectados por el VHC son más controvertidos. La mayoría de los trabajos desarrollados hasta la fecha sobre el potencial mutagénico de la RBV en pacientes con HCC se han valido de técnicas de secuenciación directa o de clonación de un bajo número de clones, lo cual podría infraestimar el verdadero potencial mutagénico de la RBV al obviar el análisis de mutaciones en las variantes minoritarias de la población viral. Recientemente, el desarrollo de nuevas técnicas de secuenciación masiva o pirosecuenciación, ha supuesto un importante avance en la investigación in vivo, al permitir la detección de mutaciones tanto de las quasiespecies mayoritarias como minoritarias, sin embargo, su aplicación en el campo del VHC aún es testimonial. Por otro lado, los estudios con secuenciación directa han demostrado la importancia de las mutaciones en determinadas regiones del genoma viral fundamentales en la respuesta al tratamiento. Si la RBV presentara potencial mutagénico su administración en monoterapia podría inducir la aparición de mutaciones en tales secuencias y condicionar los resultados terapéuticos. La correlación entre mayores tasas plasmáticas de RBV (TPR) y mejores resultados de respuesta virológica ha sido también demostrada, por lo que el diseño de estrategias dirigidas a aumentar la exposición a la RBV constituye una opción atractiva. La mayoría de los estudios que han incluido una pauta de inducción con RBV en monoterapia antes del tratamiento combinado se han limitado al análisis de su mecanismo de acción, sin analizar la influencia sobre otros parámetros intracelulares importantes en la valoración de la respuesta al tratamiento.
Justificación Bajo la incógnita de su forma de actuación, nosotros hemos planteado un estudio en el que pacientes con HCC-1 naive recibieron RBV en monoterapia 4 semanas antes del tratamiento combinado estándar con peg-IFN/RBV, analizando las mutaciones en la secuencia mayoritaria del genoma viral de la región Core, NS5B y NS5A (ISDR y PKRbd) durante ambos periodos de tratamiento, y valorando la influencia de esta pauta de inducción con RBV en la cinética viral, las TPR, la dinámica de las alaninoaminotransferasas (ALT), el desarrollo de anemia y los resultados terapéuticos. Posteriormente, se ha realizado la secuenciación masiva o pirosecuenciación de la región NS5A, comparando la secuencia del periodo basal y tras un mes con RBV monoterapia, para dilucidar el posible potencial mutagénico letal de la misma.
Hipótesis La RBV en monoterapia previa al tratamiento combinado con peg-IFN/RBV en pacientes con HCC-1 aumenta la predisposición celular al efecto del IFN, y por tanto potencia la susceptibilidad de respuesta viral al tratamiento (disminuyendo la CV y ALT, y aumentando las TPR y el número de mutaciones en regiones importantes para la replicación viral). Además, la RBV podría actuar sobre la población viral aumentando el número de quasiespecies e induciendo la ¿catástrofe error¿ Objetivos 1. Analizar la influencia de la administración de RBV antes del tratamiento combinado con peg-IFN/RBV en la cinética viral, niveles de ALT, anemia, TPR y respuesta al tratamiento antiviral.
2. Analizar el efecto mutagénico de la RBV: 2.1 Estudio de mutaciones en la secuencia mayoritaria de las regiones Core,NS5B, ISDR y PKRbd del genoma del VHC en los periodos basal, tras un mes de RBV monotorapia y tras un mes de peg-IFN/RBV, y su relación con la respuesta al tratamiento antiviral.
2.2 Estudiar las poblaciones genómicas mayoritarias y minoritarias del VHC por pirosecuenciación masiva en la región NS5A en los periodos basal y tras un mes de RBV monoterapia, para demostrar la teoría de la ¿catástrofe error¿.
Métodos Estudio de cohorte prospectivo basado en 27 pacientes de raza blanca, españoles, con HCC-1 naive, que recibieron tratamiento con RBV en monoterapia durante 4 semanas previamente al inicio del tratamiento combinado con peg-IFN-¿-2a/RBV durante 48 semanas (Grupo A) en el Hospital Universitario San Cecilio (Granada). El Grupo A se ha comparado con otro grupo control histórico (Grupo B) de 54 pacientes (1x2) que fueron seleccionados aleatoriamente mediante el programa SPSS 15.0 de Windows de una base de datos histórica de 119 pacientes con HCC-1 naive que también recibieron tratamiento con peg-IFN-¿-2a/RBV durante 48 semanas en el mismo centro, comprobando que tuviesen muestras de suero en los tiempos de estudio. Se realizaron extracciones de sangre en distintos momentos del estudio procediendo a la obtención de suero y plasma almacenándose a -80°C. El suero se dividió en 2 alícuotas que se usaron para el estudio virológico (genotipo, RNA-VHC, CV), y dos alícuotas de plasma para el estudio bioquímico y para la TPR. Los momentos del estudio fueron los siguientes:
A. Cinética viral: Grupo A: Basal antes de la RBV en monoterapia y al finalizar la misma (D0), en los días 2, 4, 8 y 15, y en las semanas 4, 12, 24, 48 (final del tratamiento) y 72 (final del seguimiento). Grupo B: antes del inicio del tratamiento combinado (basal), en las semanas 4, 12, 24 y 48 de tratamiento, y en la semana 72 (final del seguimiento).
B. TPR: Al final de la administración de RBV en monoterapia (D0), y en las semanas 4, 8, 12 y 16 del tratamiento combinado en ambos grupos.
C. Niveles de hemoglobina (Hb): antes del inicio del tratamiento (basal), tras completar 4 semanas de RBV en monoterapia en el Grupo A (D0), en las semanas 4, 8, 12, 16, 36, 48 (final del tratamiento) y 72 semanas (final del seguimiento) del tratamiento combinado en ambos grupos.
D. Niveles de ALT: antes del inicio del tratamiento con RBV en monoterapia (basal) y al final del mismo (día 0) en el Grupo A, y en las semanas 4, 12, 24, 36 y 48 (final del tratamiento) y 72 (final del seguimiento) del tratamiento combinado en el Grupo A y B.
En una segunda etapa procedimos al análisis del efecto mutagénico de la RBV en el Grupo A (pacientes que recibieron 4 semanas de RBV en monoterapia). Para ello, se determinaron las mutaciones silenciosas (la sustitución de un nucleótido no implica un cambio de aminoácido) y no silenciosas (la sustitución de un nucleótido implica un cambio de aminoácido) presentes en la secuencia mayoritaria de las regiones Core, NS5B y NS5A (ISDR y PKRbd) del genoma del VHC por secuenciación directa en el momento basal, tras 4 semanas de RBV en monoterapia y tras 4 semanas de tratamiento combinado con peg-IFN/RBV. Finalmente, se procedió a la secuenciación masiva de la región NS5A completa mediante pirosecuenciación de un paciente del Grupo A seleccionado al azar mediante el programa SPSS para completar el estudio mutagénico.
Resultados 1. Las tasas de respuesta virológica rápida (RVR), respuesta virológica precoz (RVP) y RVS no difirieron entre ambos grupos de tratamiento.
2. Los pacientes que recibieron 4 semanas de RBV en monoterapia (Grupo A) presentaron un mayor descenso del RNA-VHC (2.3 log10IU/mL vs 1.2 log10IU/mL; p=0.04), menores niveles de ALT (23.5±1.33U/L vs 60.11±18U/L; p<0.001) y mayores TPR (3.28±1.26mg/L vs 1.74±0.7mg/L; p=0.001) que los pacientes del Grupo B.
3. No observamos un aumento de las mutaciones de nucleótidos durante la administración de RBV en las regiones NS5B, ISDR o PKRbd, y si un descenso de las mutaciones silenciosas (nucleótidos) en la región Core, pudiendo deberse a que un aumento de mutaciones en dicha región, que es muy estable, condicione una selección negativa o que determinadas poblaciones virales se extingan por ¿error catástrofe¿ prevaleciendo aquellas menos mutadas.
4. Al separar a los pacientes en RVS y no-RVS, observamos que los pacientes con RVS presentan mayor número de mutaciones en los tres periodos de estudio en las regiones del Core (no silenciosas) y NS5A (ISDR y PKRbd), aunque no encontramos diferencias estadísticamente significativas.
5. La RBV en monoterapia durante 4 semanas no aumenta el número de cuasiespecies de la población viral tras el estudio mediante pirosecuenciación, confirmando la ausencia de su potencial mutagénico letal.
Conclusiones La RBV en monoterapia antes del tratamiento combinado con peg-IFN/RBV no mejora las tasas de respuesta virológica en pacientes con HCC-1 naive, pero el mayor descenso de la carga viral y los niveles de ALT, y las mayores TPR, podría reflejar una mayor efectividad del tratamiento posterior con peg-IFN. La RBV no presenta poder mutagénico in vivo.
