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Aplicación de la tecnología maldi-tof ms para la detección de carbapenemasas

  • Autores: Yannick Hoyos Mallecot
  • Directores de la Tesis: José María Navarro Marí (codir. tes.), José Gutiérrez Fernández (codir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2015
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Gómez Jiménez (presid.), Fernando Martinez Checa Barrero (secret.), Laurent dortet (voc.), Manuel Colmenero Ruiz (voc.), José Leiva León (voc.)
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
  • Resumen
    • Introducción:

      Los carbapenems (imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem) son los antibióticos betalactamicos de mayor espectro de actividad, incluyendo un gran numero de bacilos Gram negativos (Pseudomonas, Acinetobacter, Enterobacterias) . Estos antibióticos tiene su uso restringido al ámbito hospitalario y suelen prescribirse en el contexto de infecciones nosocomiales. Tienen una excelente actividad antibacteriana debido a su elevada permeabilidad y a la gran estabilidad frente a la gran mayoría de betalactamasas.

      La resistencia a los carbapenems se debe mayoritariamente a la perdida de porinas para estos antibióticos junto con una producción de alguna cefalosporinasa o alguna betalactamasas de espectro extendido (BLEEs), pero últimamente esta apareciendo un nuevo fenómeno de resistencia ligado a la producción de betalactamasas con una extraordinaria actividad frente a los carbapenems: las carbapenemasas.

      Estas enzimas se dividen en tres clases según la clasificación de AMBLER:

      ¿ La clase A: cuyos máximos representantes son las enzimas del tipo SME, IMI, NMC, KPC y GES. Su particularidad reside en que son inhibidas in-vitro por el acido borónico y por el acido clavulánico. Hidrolizan todos los beta-lactamicos.

      ¿ La clase B: son metalo-ß-lactamasas del tipo IMP, VIM, NDM, SPM, GIM y SIM. Necesitan zinc en su centro activo lo que explica su inhibición por agentes quelantes de cationes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o el ácido Dipicolínico, sin embargo no se ven afectadas por inhibidores suicida tipo clavulánico o tazobactam. Hidrolizan todos los betalactámicos a excepción del aztreonam.

      ¿ La clase D: corresponde a las enzimas de tipo oxacilinasas (OXA-48, OXA-163, OXA-181), estas enzimas son activas frente a los carbapenems pero poco o muy poco activas frente a cefalosporinas de tercera generación, si bien suelen ir siempre acompañadas de una coproducción de BLEEs confiriendo así una multiresistencia a la bacteria. Este tipo de enzimas tampoco se ve afectada por inhibidores suicidas.

      Tradicionalmente la detección de carbapenemasas se basa en un primer screening basado en el análisis del fenotipo de resistencia obtenido a partir de un antibiograma clásico, posteriormente se puede utilizar las propiedades de inhibición de cada grupo para confirmar la presencia de un determinado tipo de carbapenemasa, si bien esto resulta muy complicado y muy laboriosos ya que los métodos descritos presentan sensibilidades y especificidades muy variables. Por ultimo la confirmación final se debe de hacer por métodos moleculares, los cuales tienen como principal inconveniente que solo detectan enzimas ya conocidas, además de que solo suelen estar disponibles en centros de referencia.

      En esta ultima década los laboratorios de microbiología clínica están sufriendo una revolución, así pues estamos viviendo una sustitución de la microbiología clásica por nuevas técnicas diagnosticas basadas en la genómica y mas recientemente en el aérea de la proteómica. Una de las características de estas ultimas es su elevada fiabilidad pero sobre todo y lo que las convierten en una herramienta fundamental es su simplicidad y su corto periodo de respuesta, pudiendo así guiar hasta 24 horas antes al clínico en sus decisiones.

      Hablar de proteómica es hablar de espectrometría de masas y en el campo de la microbiología clínica eso es sinónimo de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF). La espectrometría de masas MALDI-TOF es un espectrómetro con una fuente de ionización en forma de láser asistida por una matriz y un analizador de tiempo de vuelo. La ionización de moléculas mediante esta técnica es mas suave que con otros tipos de espectrómetros lo que permite analizar moléculas de mayor tamaño, poco volátiles y sensibles al calor sin que se degraden por eso se utiliza para el análisis de biomoléculas como péptidos, proteínas, glicoproteínas o oligonucleótidos. Se trata de un método que, mediante la aplicación de energía láser a una muestra embebida en una matriz, consigue vaporizar e ionizar esa matriz, y puede eventualmente producirse un fenómeno de arrastre que ionice a su vez una parte representativa de las proteínas contenidas en la muestra. Esas proteínas ionizadas son sometidas a aceleración en un campo eléctrico y a una migración a través de un tubo de vacío hasta un detector. El tiempo que transcurra desde su vaporización/ionización hasta su detección dependerá del cociente masa/carga (m/z) de esa proteína, y ese cociente m/z permitirá determinar la masa exacta de la proteína de manera extremadamente fiable.

      En el caso de los microorganismos, se genera de esta forma un perfil de proteínas con diferentes cocientes m/z, que se comporta como una huella dactilar, permitiendo identificar con gran fiabilidad al microorganismo a partir de dicho perfil mediante su comparación con una base de datos previamente creada. Esta es la utilidad para la que fueron diseñados estos aparatos en el campo de la microbiología clínica, pero tratándose de un espectrómetro de masas sus aplicaciones son ilimitadas por lo que no es de extrañar que se haya intentado utilizar este tipo de instrumentos con otros fines como el estudio de relaciones entre microorganismos mediante el análisis de su perfil proteico o la detección de mecanismos de resistencia, siempre con el mismo objetivo de acortar el tiempo de respuesta frente métodos tradicionales mas tradicionales.

      Justificación y desarrollo:

      Tres factores explican la alarma creada ante este tipo de microorganismos:

      ¿ Su elevada diseminación por transferencia a través de plásmidos. Es inevitable la comparación con la evolución de las cepas productores de CTX-M en la ultima década, lo cual hace suponer que si no ponemos los medios necesarios dentro de poco encontraremos este tipo de microorganismos multiresistentes no solo en el ámbito hospitalario ¿ La extrema dificultad para detectar este tipo de mecanismos de resistencia ya que a día de hoy no parece haber un método totalmente fiable para poder descartar la presencia de una carbapenemasa.

      ¿ La posibilidad de fracaso terapéutico usando carbapenems sí hay alguna carbapenemasa implicada ( aunque la cepa en cuestión sea sensible a carbapenems en el antibiograma).

      Parece evidente que tanto a nivel epidemiológico como a nivel clínico es necesario la puesta apunto de nuevos métodos de diagnostico rápidos y fiables para la detección de cepas productoras de carbapenemasas con el fin de optimizar el tratamiento y de limitar la difusión de este tipo de enzimas.

      En el caso de las carbapenemasas, al ser un mecanismo enzimático, estas enzimas van a provocar la inactivación de los antibióticos betalactámicos mediante una hidrolisis de su anillo central, con la consiguiente incorporación de una molécula de agua y por lo tanto un incremento del peso molecular de este compuesto de unos 18 Da. Este cambio de masa se puede monitorizar mediante MALDI-TOF MS, de modo que las cepas no productoras de carbapenemasas no modificaran el peso molecular del carbapenem.

      Este método comparado con los métodos de rutina clásicos proporcionaría una información mucho mas rápida ya que esta basada en una actividad enzimática y no en un crecimiento bacteriano que requiere incubaciones de al menos 24 horas.

      Basándonos en la posibilidad de detectar indirectamente la hidrólisis enzimática producida sobre los anillos ß-lactamicos, nuestro objetivo fue poner a punto esta metodología para poder aplicarla a la detección de carbapenemasas a partir de cultivos bacterianos o de muestras directas como los hemocultivos.

      Para ello se puso a punto la técnica a partir de cultivos de 24 horas sobre agar Muller-Hinton. Una vez a punto esta técnica se valido mediante un estudio prospectivo durante un periodo de 5 meses, aprovechando así para evaluar la incidencia de este tipo de microorganismos en nuestro medio. Adicionalmente también se utilizo esta metodología para detectar la presencia de este tipo microorganismos en una muestra clínica tan relevante como son los hemocultivos.

      Conclusiones:

      Respecto a la incidencia de cepas productoras de carbapenemasas esta fue bastante moderada con respecto a lo descrito en otras regiones. Si bien en nuestro hospital no se realiza de manera sistemática estudios de portadores lo que podría explicar el bajo numero de cepas productoras de carbapenemasas halladas.

      Respecto a la detección de carbapenemasas mediante MALDI-TOF, podemos concluir que es un a técnica fácil y muy fiable ya que presento una sensibilidad y una especificidad del 100 % durante el estudio prospectivo. Su aplicación para la detección directamente del hemocultivo resulto también excelente si bien debido a la baja incidencia de este tipo de microorganismos a día de hoy hace que no sea un técnica sugerente de incluirse en rutina.

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