Resumen de Hilos moleculares basados en híbridos de oligonucleótidos y metales de transición
Noelia de la Luz Santamaría Díaz
El reto científico-tecnológico que plantea esta tesis doctoral consiste en desarrollar metodologías eficientes para conferir propiedades de interés tecnológico a los oligonucleótidos, con el fin de obtener nanomateriales con propiedades a la carta. En concreto, esta tesis persigue diseñar, sintetizar, caracterizar estructuralmente y estudiar las propiedades conductoras de nuevos hilos moleculares, basados en sistemas híbridos metal-ADN, obtenidos mediante procesos de auto-ensamblaje entre oligonucleótidos y compuestos de coordinación previamente diseñados o mediante la formación de oligonucleótidos que contengan iones de Ag(I) intercalados entre dobles la hebra de ADN, es decir, a través de la formación de pares de bases mediados por iones de Ag(I).
Estos objetivos se pretenden conseguir mediante el desarrollo de dos metodologías:
1. Mediante procesos de auto-asociación entre de los complejos metálicos, previamente programados, y moléculas de ADN de cadena simple.
2. Mediante el empleo de oligonucleótidos que contengan la nucleobase artificial 7-deaza-adenina en su secuencia de bases, con objeto de formar pares de bases mediadas por enlaces de coordinación.
3. Estudios de conductividad de los sistemas híbridos metal-ADN A continuación se resumen los resultados obtenidos mediante el desarrollo y empleo de ambas estrategias. Finalmente, se resumirán los resultados obtenidos en el estudio de las propiedades conductoras de los híbridos metal-ADN obtenidos a partir de la formación de pares de bases mediados por iones de Ag(I).
- Procesos de auto-asociación entre complejos metálicos y moléculas de ADN de cadena simple:
Para este estudio se ha llevado a cabo, en primer lugar, el diseño y la síntesis de diferentes moléculas orgánicas que puedan actuar como ligandos y formar complejos metálicos, los cuales interactuarán posteriormente con las nucleobases o las hebras de oligonucleótidos.
Los ligandos orgánicos estudiados en este trabajo de tesis tienen las siguientes características en común:
1. Son moléculas aromáticas-planos capaces de dar lugar a interacciones de apilamiento π-π 2. Son capaces de formar enlaces de hidrógeno cooperativos con los grupos amino y/o carbonilo complementarios presentes en las nucleobases 3. Son capaces de coordinarse a iones metálicos sin deterioro de las características anteriormente expuestas 4. Son portadores de grupos susceptibles de ser funcionalizados con objeto de introducir nuevas propiedades físico-químico en estos sistemas y sin poner en peligro las características anteriores.
Con estos objetivos se han sintetizado tres tipos de ligandos, clasificados de acuerdo a los grupos portadores capaces de formar enlaces de hidrógeno con las nucleobases:
a) Ligandos hidroxo-hidroxo, que contienen grupos hidroxilo y/o carboxilo capaces de formar enlaces de hidrógeno con los grupos amino de las nucleobases (adenina y 7-deaza-adenina) b) Ligandos de tipo hidroxo-amino, portadores de grupos carboxilo y amino, capaces de formar enlaces de hidrógeno con los grupos carbonilo y amino de las nucleobases (guanina, 7-deaza-guanina y citosina) c) Ligandos de tipo amino-amino, poseedores de grupos amino capaces de formar enlaces de hidrógeno con los grupos carbonilo de las nucleobase timina.
Posteriormente, se llevó a cabo una selección de los ligandos orgánicos más apropiados para obtener complejos metálicos primarios mediante su reacción con iones de Pd(II), Pt(II) y/o Cu(II). La elección de iones metálicos, tales como Pd(II) o Pt(II) se a la gran tendencia que tienen estos iones para dar complejos con geometría plano-cuadrada, la alta afinidad de estos metales por átomo de nitrógeno donadores localizados en posiciones específicas de las bases nitrogenadas, la robustez de los enlaces de coordinación formados y al control de su reactividad a través del uso de ciertos grupos de coordinación al ión metálico. Sin embargo, se han sintetizado también complejos con Cu(II), cuyos enlaces de coordinación son más lábiles, su cinética de reacción es más rápida y además permite entornos de coordinación más variados.
A continuación se llevaron a cabo estudios de interacción entre complejos primarios de Pd(II), Pt(II) y Cu(II), seleccionados por sus propiedades, y las nucleobases modelos 1-metilcitosina (mC), 9-metil-7-deaza-adenina (mdA), 9-propil-7-deaza-adenina (pdA), 9-propil-guanina (pG), 9-propil-7-deaza-guanina (pdG) y/o 1-etil-timina (eT).
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la coordinación de los complejos primarios cheldPd, 2Pd y cheldPt (derivados de ligandos de tipo hidroxo-hidroxo) con las nucleobases modelo 1-metilcitosina (mC), 9-metil-7-deaza-adenina (mdA) y 9-propil-7-deaza-adenina (pdA), sin que se hayan obtenido complejos con las nucleobases 9-propil-guanina (pG) o 1-etil-timina (eT), debido en ambos casos, a la repulsión entre los grupos carbonilo de estas nucleobases y los grupos hidroxo de los complejos, junto con la necesidad de desprotonación de las mismas.
Las interacciones del complejo cheldPd y cheldPt con las diferentes nucleobases han sido estudiadas tanto en fase sólida (IR y DRX, en aquellos casos en los que se obtuvieron cristales adecuados del complejo) como en disolución (1H-RMN, HRMS, UV-visible). En el caso del complejo 2Pd estos estudios sólo pudieron ser llevados a cabo en disolución (1H-RMN, HRMS) debido a la dificultad para aislar dicho complejo en fase sólida.
El análisis estructural mediante DRX de los complejos cheldPd_mC y cheldPd_pdA permitió determinar que sólo la interacción complejo-nucleobase para el complejo cheldPd_pdA tiene lugar de forma casi coplanar (1.62°), interacción que se ve estabilizada por la formación de un enlace de hidrógeno intramolecular entre el grupo amino exocíclico de la nucleobase pdA y uno de los grupo carboxilato del complejo cheldPd. Este efecto también tiene lugar en el complejo cheldPt_pdA, isoestructural a su análogo de Pd(II), presenta un ángulo diedro de 1.49°. Sin embargo, en el caso del complejo cheldPd_mC, la interacción complejo-nucleobase ocurre de forma casi perpendicular (74.96°) sin que lleguen a formarse enlaces de hidrógeno complejo-nucleobase.
De esta manera, y gracias a los estudios de DRX, se han puesto en evidencia la formación de enlaces de hidrógeno de tipo Watson-Crick entre los grupos carboxilato de los complejos cheldPd, cheldPt y el grupo amino de la nucleobase 7-deaza-adenina. Igualmente, ha sido posible estudiar la repulsión originada por los grupos carboxilato de estos complejos y el grupo carbonilo de la 1-metil-citosina.
Los estudios de interacción complejos primarios de Cu(II) con nucleobases solo se realizaron para el complejo 1Cu (derivado de ligando hidroxo-hidroxo), obteniéndose información sobre la capacidad de este complejo para interaccionar con pares de bases mediante la formación de enlaces de coordinación y de hidrógeno cooperativos.
Debido a los grupos carboxilato del complejo, las nucleobases modificadas que contengan grupos amino exocíclicos en su estructura van a ser las más favorables para que tenga lugar la interacción (adenina, citosina y guanina) ya que estas nucleobases podrán formar enlaces de hidrógeno cooperativos. Sin embargo aquellas nucleobases que posean grupos carbonilos (citosina, guanina y timina) tendrán una alta probabilidad de originar repulsiones electrostáticas que dará lugar a un distanciamiento de dichos grupos. Para estudiar este tipo de interacciones se han sintetizado y caracterizado complejos de 1Cu con las nucleobases modificadas N3-metil-citosina (mC), N9-etil-timina (eA), N9-propil-7-deaza-adenina (pdA) y N9-propil-guanina (pG).
Desafortunadamente no se han obtenido complejos entre la timina y 1Cu, probablemente debido las repulsiones electrostáticas anteriormente descritas. Los estudios se han realizado tanto en estado sólido como en disolución.
La determinación estructural mediante DRX de los complejos 1Cu_mC, 1Cu_eA, 1Cu_pdA y 1Cu_pG permitió determinar que la interacción entre el complejo y la nucleobase para el complejo 1Cu_eA tiene lugar de forma casi coplanar (6.97°) favoreciendo la formación de un enlace de hidrógeno intramolecular entre el grupo amino de la nucleobase y el grupo carboxilato del complejo. Sin embargo, para los complejos de 1Cu_mC, 1Cu_pdA y 1Cu_pG, no se observa la interacción coplanar complejo-nucleobase (77.73°, 45.67° y 80.41°, respectivamente).
De acuerdo con los resultados obtenidos previamente, los complejos chleldPd y 1Cu, serían buenos candidatos para estudiar su interacción y organización a lo largo de hebras de ADN de cadena simple. Por ello, estos complejos se utilizaron en los estudios de interacción frente a oligonucleótidos de cadena simple. Los oligonucleótidos frente a los que se ha estudiado esta interacción complejo-nucleobase consisten en secuencias homogéneas formadas por quince bases, canónicas como la adenia (A), la citosina (C), la guanina (G) y no canónicas como la 7-deaza-adenina (7CA). El propósito de estos estudios ha sido que los complejos metálicos interaccionen con éstas monohebras homogéneas dando lugar al auto-ensamblaje de los mismos mediante la formación de un enlace de coordinación con uno de los átomos de nitrógeno disponibles en la nucleobase, así como por enlaces de hidrógeno que estabilicen y refuercen la interacción en este tipo de sistemas. Interacción que se ha comprobado que tiene lugar al realizar los estudios estructurales de los complejos metálicos y las mononucleobases.
El complejo cheldPd se ha ensayado frente a las monohebras poly15A y poly15(7CA) mientras que el complejo 1Cu se ha ensayado frente a las monohebras poly15A, poly15(7CA), poly15C y poly10G.
- Síntesis de oligonucleótidos que contengan pares de bases mediadas por enlaces de coordinación:
Otra de las estrategias llevadas a cabo para la formación de híbridos metal-oligonucleótido ha consistido en el estudio de la formación de pares de bases mediadas por enlaces de coordinación. Se ha desarrollado una nueva estrategia que permite a un oligonucleótido auto-ensamblarse a través de sus enlaces de hidrógeno Watson-Crick, y que posteriormente se transforman en interacciones Watson-Crick pero mediadas por un enlace de coordinación en presencia de iones Ag(I).
Concretamente, se ha sintetizado y caracterizado un oligonucleótido de 18 pares de bases de tipo 7CA-T alternadas. Este oligonucleótido es capaz de alojar iones Ag(I) en el interior de su doble hebra a través de la formación de pares de bases del tipo 7CA-Ag+-T, donde un enlace de hidrógeno es reemplazado por un enlace de coordinación a un ion Ag(I) central.
La formación de este sistema metal-ADN constituido por pares de bases mediados por iones Ag(I) ha sido estudiado por diferentes técnicas cómo espectroscopia UV, dicroísmo circular, estabilidad térmica y HRMS.
Estos estudios han demostrado que es posible la formación de híbridos metal-oligonucleótido, altamente estables, a partir de un oligonucleótido previamente organizado a través de sus enlaces de hidrógeno Watson-Crick, mediante la sustitución de los enlaces de hidrógeno por enlaces de coordinación a unión Ag(I).
- Estudios de las propiedades conductoras de oligonucleótidos que contengan pares de bases mediadas por iones Ag(I) consecutivos:
Por último, se ha llevado a cabo un estudio de las propiedades conductoras en los sistemas formados por dobles hebras de oligonucleótido capaces de alojar iones Ag(I) en su interior mediante la formación de pares de bases mediados por dicho ión. Estos estudios se han realizado mediante el empleo de la técnica STM-break junction en colaboración con expertos en este campo como el Prof. Richard Nichols de la Universidad de Liverpool.
Se han realizado medidas de conductividad para estudiar el efecto de la formación de pares de bases 7CA-Ag+-T en el transporte de carga que tiene lugar en oligonucleótidos con pares de bases 7CA-T. Además, estos estudios han servido para estudiar cómo afecta la sustitución de nucleobase canónica adenina por 7-deaza-adenina al valor de la conductancia. Los oligonucleótidos empleados han sido la poly6(NH2-A-T), la poly6(NH2-7CA-T) y la poly10(NH2-7CA-T) capaces de dar lugar a pares de bases mediados por iones Ag(I) y adecuados para llevar a cabo las medidas de conductividad, ya que han sido modificados con un grupo amino terminal que permite la fijación del oligonucleótido a la superficie de deposición de la muestra y a la punta del STM.
Una vez analizados los datos obtenidos por STM-BJ, se ha comprobado que el transporte de carga, que tiene lugar de forma natural entre pares de bases gracias al apilamiento π-π* de las nucleobases, no se ve afectado tras la interacción de iones Ag(I) con los pares de bases originando híbridos 7CA-Ag+-T; aunque la formación de estos sistemas implique un aumento en la estabilidad. Además de comprobar que la sustitución de la nucleobase canónica adenina por 7-deaza-adenina en el oligonucleótido no implica cambio alguno en el valor de la conductancia.
