Francisco Jesús Ruiz Ruano Campaña
El saltamontes Locusta migratoria es el causante de una de las plagas más devastadoras sobre la agricultura: las plagas de langosta. Su genoma se caracteriza por tener uno de los sistemas de cromosomas B más ampliamente distribuidos de todos los estudiados en plantas y animales, puesto que se ha encontrado en poblaciones naturales de Asia, África, Australia y Europa. Con anterioridad al presente trabajo, se sabía que el cromosoma B de L. migratoria contiene genes para las histonas H3 y H4. La comparación de la secuencia de estos genes entre los cromosomas A y B ha sugerido que el cromosoma B probablemente derivó del autosoma 8, ya que éste es el único cromosoma A que muestra genes para las histonas H3 y H4. La divergencia en secuencia para estos genes entre cromosomas A y B proporcionó una primera estima de la edad mínima del cromosoma B (750.000 años). El objetivo general de esta tesis doctoral es profundizar en el conocimiento del origen y evolución de los cromosomas B de L. migratoria mediante el análisis de su contenido molecular, tanto de ADN repetitivo como de genes codificadores de proteínas, que puede ser indicativo de su posible origen y papel biológico.
Para ello, hemos llevado a cabo la secuenciación masiva de ADN genómico y ARN mensajero obtenidos de individuos portadores y no portadores de cromosomas B procedentes de poblaciones naturales localizadas en Padul (Granada) y Los Barrios (Cádiz), y complementamos esta información con secuencias de ADN y ARN obtenidas de individuos de China disponibles en las bases de datos públicas. Para probar las nuevas metodologías desarrolladas en el transcurso de esta tesis, también hemos llevado a cabo análisis genómicos en los saltamontes Eumigus monticola y Eyprepocnemis plorans.
En el primer capítulo, realizamos un estudio genómico y citogenético de los microsatélites en los cromosomas A y B de L. migratoria y E. plorans. Para ello, combinamos la información de su localización cromosómica, aportada por los mapeos físicos de una selección de microsatélites, con el análisis bioinformático de lecturas genómicas obtenidas por pirosecuenciación 454 para estimar la abundancia de todos los microsatélites y su asociación con otros elementos repetidos. Así hemos determinado que los microsatélites constituyen el 0.54% y el 0.46% de los genomas de L. migratoria y E. plorans, respectivamente. Están localizados tanto en regiones eucromáticas no codificantes, en su mayoría próximas a elementos transponibles, como en espaciadores de histonas y el espaciador intergénico del ADN ribosómico 45S. Dado que L. migratoria tiene un genoma más pequeño y rico en microsatélites que E. plorans, está claro que el contenido en microsatélites no explica las diferencias en tamaño genómico entre estas dos especies, ni el tamaño gigante de los genomas de saltamontes. Los cromosomas B de ambas especies son heterocromáticos y resultaron estar empobrecidos en microsatélites. El cromosoma B de L. migratoria tiene más concentración de microsatélites en el tercio eucromático proximal, coincidiendo con la localización del cistrón de histonas. Por otro lado, en el cromosoma B de E. plorans los microsatélites se localizan, sobre todo, en las bandas intersticiales DAPI y en el IGS del ARNr 45S.
El ADN satélite es uno de los principales componentes, aunque el gran desconocido, de los genomas eucarióticos. En el segundo capítulo, desarrollamos una serie de herramientas de análisis para descubrir el mayor número posible de ADNs satélites en el genoma de L. migratoria. Hasta el momento no se habían descrito secuencias de este tipo en esta especie mediante procedimientos in vitro, por lo que hemos desarrollado satMiner, un protocolo de análisis in silico para ensamblar y describir los ADNs satélites de un genoma. Proponemos el término satelitoma para denominar al conjunto de familias de ADN satélite presentes en el genoma. Concretamente, el satelitoma de L. migratoria consta de 62 familias de ADN satélite con longitudes de monómero entre 5 y 400 pb. El análisis en profundidad del satelitoma de esta especie, combinando el análisis bioinformático con el mapeo físico mediante FISH, nos ha llevado a proponer un modelo de evolución del ADN satélite, por el que éste se origina mediante duplicación segmental en una localización discreta del genoma, luego se disemina a otras localizaciones genómicas de cromosomas homólogos y no homólogos, y finalmente se clusteriza mediante amplificación local. Sólo después del último paso los ADNs satélites son visibles mediante FISH. En bacterias existen repeticiones en tándem variables en número (VNTRs) que muestran propiedades similares a los ADNs satélites no clusterizados de eucariotas, sugiriendo que muchas propiedades de estos elementos repetitivos en tándem son comunes a todos los seres vivos.
Para probar los procedimientos de análisis desarrollados en el capítulo anterior, hemos analizado también el satelitoma en individuos con y sin cromosomas B del saltamontes Eumigus monticola, una especie que muestra cromosomas B mitóticamente inestables, como los de L. migratoria. En este tercer capítulo, utilizamos marcadores citogenéticos clásicos, como bandas C, tinción DAPI y FISH para el gen de la histona H3 y para el ADNr 5S, y a la vez analizamos el satelitoma de esta especie. Mientras que las familias génicas dieron información muy pobre con respecto al origen del cromosoma B, el satelitoma fue decisivo. Está compuesto por 27 familias de ADN satélite, con monómeros entre 5 y 325 pb. El octavo cromosoma en tamaño (S8, también denominado megamérico) es el cromosoma del genoma A que contiene más ADN satélite (13 familias), y el cromosoma B contiene seis de ellos, todos localizados en el tercio proximal del S8. Además, el cromosoma B contiene el ADNr 5S que también está presente en el S8, pero no lleva los genes de histonas de este último. Todo esto indica que el cromosoma B de esta especie se originó a partir del tercio proximal del autosoma S8, incluyendo el ADN satélite EmoSat11-122 pero no los genes para histonas. Finalmente, la formación de novo de dos ADNs satélites en el cromosoma B, que solo muestran señales de FISH en el cromosoma B, sugiere que la presencia de ADNs satélites específicos de un cromosoma B no apoyan necesariamente el origen interespecífico de éste.
En el cuarto capítulo abordamos el estudio del contenido en ADN repetitivo del cromosoma B de L. migratoria. Para ello, primero hemos realizado el ensamblaje y anotación de la familia de genes para histonas que, hasta el momento, no había sido caracterizada en ortópteros. Esta familia génica tiene un tamaño total de 8.262 pb, con una estructura H1 H3 H4 H2A H2B para los cinco genes. El espaciador 5 mostró algunas variantes estructurales características de los individuos con B. Una de ellas consistía en una serie de deleciones específicas del cromosoma B que permitieron diseñar un marcador molecular de la presencia del cromosoma B. Además, hemos determinado que los elementos repetitivos representan el 55% del genoma 0B de L. migratoria. Restando in silico la abundancia de elementos repetitivos en las librerías genómicas con B y sin B hemos inferido que los cromosomas B están enriquecidos en genes para histonas y ADN satélite, pero empobrecidos en elementos transponibles (ETs). Es notable que un solo ADN satélite (LmiSat02-176) representa el 70% del ADN repetitivo del cromosoma B, y el análisis mediante FISH demostró que está localizado por toda la longitud del cromosoma B. Además, los experimentos de FISH demostraron la presencia de otros 6 ADNs satélites en el cromosoma B, estando todos ellos presentes en el autosoma S9. Esto apunta a que este cromosoma jugó un papel en el origen del cromosoma B, tal vez mediante una translocación con el cromosoma S8, el único cromosoma A que comparte con el B la presencia de genes para histonas. El análisis in silico de la abundancia de ETs mostró que, a pesar de la escasez general de ETs, los cromosomas B están enriquecidos particularmente en algunos tipos. El mapeo mediante FISH para algunos de estos elementos mostró que están clusterizados en una región específica del cromosoma B, concretamente en la región heterocromática próxima al límite con la región eucromática. El uso de lecturas de pirosecuenciación 454 permitió ensamblar una secuencia quimérica de más de 17.000 pb que incluye fragmentos de 29 ETs distintos, lo que indica que esta región del cromosoma B es un sumidero de ETs. Finalmente, demostramos la expresión de algunos ETs portadores de SNPs específicos del B, sugiriendo que estas copias del cromosoma B están activas.
En el último capítulo, investigamos la presencia de genes codificadores de proteínas en el cromosoma B de L. migratoria, desafiando la convención general que asume que los cromosomas B son elementos genéticamente inertes. Mediante análisis bioinformático de genomas y transcriptomas con B y sin B, hemos localizado 24 genes en el cromosoma B, 12 de los cuales están completos. Encontramos SNPs específicos del B en muchos genes que indicaron que éstos son transcritos activamente. Además, algunos de ellos podrían ser muy importantes para la transmisión del cromosoma B por estar involucrados en la regulación del ciclo celular. Uno de los genes más llamativos es APC1, que codifica para la subunidad mayor del complejo proteico promotor de la anafase, que promueve el paso de metafase a anafase durante la mitosis. Esto facilita que las células metafásicas donde sólo una de las cromátidas del B esté unida a las fibras del huso puedan progresar hacia anafase, debido al exceso de APC1, promoviendo así la no-disyunción mitótica del cromosoma B. Esto podría constituir la explicación para los dos mecanismos de acumulación conocidos para este cromosoma B. Además, el cromosoma B tiene activos otros dos genes que codifican para ubiquitin ligasas tipo E3, que pueden modificar postraduccionalmente la expresión de muchos genes de los cromosomas A. Esto demuestra que los cromosomas B son transcripcionalmente activos y que su contenido génico podría jugar un papel muy relevante en su éxito evolutivo. Esto los convierte en auténticos parásitos, capaces de manipular la expresión génica del genoma hospedador en su propio beneficio.
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