Metodologías avanzadas para la determinación de 5-nitroimidazoles en muestras alimentarias, ambientales y clínicas
- Autores: Maykel Hernández Mesa
- Directores de la Tesis: Ana María García Campaña (dir. tes.), Carmen Cruces Blanco (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Navalón Montón (presid.), Monsalud del Olmo Iruela (secret.), Javier Hernández Borges (voc.), Václav Kašička (voc.), Alberto Escarpa Miguel (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Química por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
El descubrimiento de los antibióticos ha supuesto grandes mejoras en la salud humana, siendo reconocido, este hecho, como uno de los factores causantes del aumento de la expectativa de vida. Además, el uso de agentes antimicrobianos en la ganadería y en general en la medicina veterinaria, ha contribuido a mejorar la salud y el bienestar de los animales, así como a disminuir los costes económicos causados por enfermedades contagiosas entre el ganado. Sin embargo, el uso extendido de los antibióticos ha supuesto la aparición de bacterias resistentes, lo cual constituye un problema de salud pública.
Los 5-nitroimidazoles (5-NDZs) son una clase de antibióticos de amplio espectro que se usan en el tratamiento de infecciones debidas a bacterias y protozoos anaerobios. Su importancia en la medicina humana ha quedado evidenciada mediante la inclusión del metronidazol (MNZ), que es el 5-NDZ más representativo, en la ‘Lista de Medicinas Esenciales’ elaborada por la Organización Mundial de la Salud (WHO). Sin embargo, a estos compuestos se le atribuyen propiedades carcinogénicas, genotóxicas y mutagénicas y como consecuencia, su uso en medicina veterinaria ha sido restringido dentro de los países europeos.
Por otra parte, y a pesar de que la presencia de residuos de 5-NDZs en alimentos de origen animal está prohibida de acuerdo con la Regulación (EU) 37/2010, todavía se siguen registrando alertas sobre este hecho en el portal del ‘Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos’ (RASFF). Por este motivo, se requieren métodos analíticos para la determinación de 5-NDZs con el objetivo de garantizar la seguridad alimentaria.
Los compuestos 5-NDZs son moléculas polares que presentan baja biodegradabilidad, y por lo tanto, son susceptibles de ser bioacumulados. Los tratamientos de aguas residuales que se llevan a cabo actualmente han resultado ser poco eficaces para la eliminación de residuos de 5-NDZs, y por lo tanto estos compuestos son emitidos al medioambiente.
De hecho, ha sido descrita la presencia de residuos de 5-NDZs en aguas residuales, superficiales y subterráneas, aunque el riesgo que suponen para la salud humana aún es desconocido y no existe ningún tipo de legislación que regule y controle su presencia. Sin embargo, es importante la monitorización de los niveles de concentración de estas sustancias en el medioambiente con el objetivo de regular su riesgo potencial.
En base a lo anterior, en esta Tesis Doctoral se describen nuevos métodos analíticos para la determinación de 5-NDZs en matrices alimentarias, ambientales y clínicas. Los métodos propuestos están basados en técnicas miniaturizadas de separación, concretamente en la electroforesis capilar (CE), la electrocromatografía capilar (CEC) y la cromatografía capilar de líquidos (CLC), debido a que éstas implican un bajo consumo de disolventes tal y como es requerido por las nuevas tendencias en la Química Analítica. Además, el uso de la cromatografía de líquidos de ultra-alta resolución (UHPLC) también se ha investigado puesto que ofrece un menor consumo de disolventes además de dar proporcionar una alta eficacia en un tiempo de análisis corto. Junto con la detección basada en la absorción ultravioleta/visible (UV/Vis), a lo largo de esta Tesis se ha considerado la espectrometría de masas (MS) debido a las ventajas que aporta como sistema de detección, tales como la identificación inequívoca de los analitos. Es importante señalar que en esta Tesis Doctoral se presentan, por primera vez, los sistemas CE-MS y CEC-MS como una herramienta para la determinación de 5-NDZs. Además, se ha propuesto el uso de tratamientos de muestra rápidos, simples y poco contaminantes con el objetivo de alcanzar una alta eficacia en la extracción y un alto rendimiento en el tratamiento de muestra. La presente Tesis se ha dividido en cuatro partes. La Parte I presenta los beneficios y los efectos adversos del uso de antibióticos (Capítulo 1), y da una visión general de los métodos analíticos que se han desarrollado recientemente para la determinación de 5-NDZs (Capítulo 2). Los estudios experimentales llevados a cabo en esta Tesis se han incluidos en las otras tres partes de acuerdo con la técnica de separación considerada para el desarrollo de cada uno de los métodos propuestos. Cada una de estas tres partes incluye un capítulo introductorio en el que se discuten las características más relevantes de la técnica de separación seleccionada.
La Parte II consiste en una introducción y tres capítulos que incluyen los métodos basados en CE propuestos para la determinación de 5-NDZs. El Capítulo 3 introduce la técnica CE y describe las estrategias desarrolladas para mejorar la baja sensibilidad inherente a estos métodos, así como presenta el acoplamiento CE-MS.
En el Capítulo 4, se propone un método de cromatografía electrocinética micelar (MEKC)-UV para la determinación de hasta nueve 5-NDZs, incluyendo alguno de sus metabolitos, en muestras de leche y aguas naturales. En dicho capítulo se evalúa la influencia de varios parámetros que afectan a la separación (pH, concentración y naturaleza del tampón, concentración del surfactante, temperatura del capilar y voltaje aplicado). Finalmente, la separación de los 5-NDZs se ha llevado a cabo a 20°C y 25 kV usando como medio de separación un tampón fosfato (20 mM, pH 6.5) conteniendo dodecil sulfato sódico (SDS) con una concentración de 150 mM. Con el objetivo de aumentar la sensibilidad, la separación se llevó a cabo en un capilar ‘burbuja’ (61.5-64.5 cm longitud total × 50 µm diámetro interno (i.d.), 150 µm longitud de paso óptico). Las señales analíticas se registraron a una longitud de onda de 320 nm. Además, se evaluó una preconcentración ‘on-line’ mediante ‘sweeping’, por lo que se consideró una inyección durante 15-25 s a 50 mbar de las muestras disueltas en tampón de separación pero en ausencia de micelas. Por otra parte, se consideró la extracción en fase sólida (SPE) con cartuchos Oasis®HLB y la microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) como tratamiento para las muestras de aguas. Para la extracción de los 5-NDZs de las muestras de leche, se evaluó la SPE usando cartuchos Oasis®MCX.
En el Capítulo 5, se ensayó una nueva técnica de preconcentración ‘on-line’ para la determinación de 5-NDZs. La estrategia considerada combina la inyección de la muestra en un campo eléctrico ampliado (FESI) y la preconcentración mediante ‘sweeping’, la cual se denomina inyección exhaustiva-selectiva de los cationes-sweeping (CSEI)-sweeping. El método propuesto consiste en el llenado del capilar con un tampón de baja conductividad (LCB; 50 mM tampón fosfato, pH 2.5), seguido de la inyección de un bolo de tampón de alta conductividad (HCB; 100 mM tampón fosfato, pH 2.5, 50 mbar, ≈ 31.5% del volumen del capilar) y finalmente de la inyección de un bolo de agua (50 mbar, 2 s). A continuación, las muestras, disueltas en una disolución con menor conductividad que el medio de separación, se inyectaron electrocinéticamente a 9.8 kV durante 632 s. Finalmente, la separación se llevó a cabo a -30 kV y 20°C usando como medio de separación un tampón fosfato (44 mM, pH 2.5) conteniendo 8% (v/v) THF y 123 mM SDS. El método propuesto se aplicó al análisis de residuos de 5-NDZs en diferentes matrices, y como consecuencia, se evaluaron diferentes tratamientos de muestras. Se aplicó un método de extracción DLLME a las muestras de agua, mientras que para las muestras de huevo, se aplicó un método de extracción SPE. Por otra parte, las muestras de orina y suero se diluyeron y analizaron directamente.
Finalmente, en el Capítulo 6, se llevó a cabo el desarrollo de un nuevo método de CE acoplado a MS con trampa de iones (CE-IT-MS) para la determinación simultánea de once 5-NDZs. Además, se llevó a cabo una comparación de dos modos de separación, MEKC y CZE, obteniendo una mayor selectividad cuando se empleó una disolución de ácido fórmico 1 M como medio de separación. Usando este medio de separación, los 5-NDZs se inyectaron hidrodinámicamente en agua (40 s, 50 mbar) y se separaron a 28 kV y 25°C en un capilar de sílice fundida (110 cm × 50 µm i.d.). Además, se aplicó al vial de entrada una presión de 50 mbar durante la separación con el objetivo de mejorar la reproducibilidad de los tiempos de migración. Por otra parte, se empleó la ionización por electrospray (ESI) en modo positivo, estableciendo una presión de nebulización de 7.4 psi, un flujo del gas de secado de 6 L/min y una temperatura del gas de secado de 160°C. Así mismo, se empleó una interfase coaxial de líquido adicional para el acoplamiento CE-MS. El líquido adicional consistía en una mezcla 2-propanol/agua/ácido acético (60.0:38.8:0.2, v/v/v) y se suministró con un flujo de 3.3 µL/min. Además, se llevó a cabo la optimización de los parámetros relativos al espectrómetro de masas con el objetivo de identificar los analitos a través de sus espectros de MS2 y MS3. El método propuesto se aplicó a la determinación de 5-NDZs en muestras de orina utilizando como tratamiento de muestra la extracción en fase sólida con polímeros molecularmente impresos (MISPE).
La Parte III consiste en una introducción y dos capítulos que presentan los métodos basados en la CEC y que se han desarrollado para el análisis de residuos de 5-NDZs. En el Capítulo 7, se describe la técnica CEC, incidiendo en los procedimientos de empaquetado de los capilares y la formación de las fritas. Asimismo, se introduce el acoplamiento CEC-MS.
En el Capítulo 8, se describe un nuevo método CEC-UV para el análisis de ocho compuestos 5-NDZs usando columnas empaquetadas en el laboratorio. Los capilares se empaquetaron a alta presión utilizando acetona como disolvente transportador y partículas C18 no-protegidas (5 µm) como material a empaquetar. Por otra parte, se consideró la sinterización de las partículas de la fase estacionaria para la fabricación de las fritas. La sinterización se llevó a cabo mediante el calentamiento de la columna con una cinta de cromo-níquel (80% Ni – 20% Cr, 28 cm × 2 mm × 0.2 mm, resistencia eléctrica 1.3 Ω) conectada a una fuente de voltaje de 7 V AC durante 20 s. Las columnas preparadas en el laboratorio (40 cm × 50 µm i.d.) se emplearon para la determinación de 5-NDZs en muestras de leche que fueron tratadas antes de su análisis mediante una extracción líquido-líquido asistida por sales (SALLE) seguida de una extracción SPE. Las muestras se inyectaron hidrodinámicamente en la columna (120 s, 11.5 bar) y los 5-NDZs se separaron en modo isocrático a 27 kV y 30 °C. Se empleó una fase móvil consistente en una mezcla 60:40 (v/v) acetonitrilo (MeCN)/tampón acetato amónico (2.5 mM, pH 5). La separación se monitorizó a 320 nm y se llevó a cabo en menos de 15 minutos.
El Capítulo 9 presenta el trabajo experimental llevado a cabo en colaboración con el grupo del Dr. Salvatore Fanali durante una estancia predoctoral desarrollada en el ‘Istituto di Metodologie Chimiche (IMC) del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Montelibretti’ (Roma, Italia). La separación de ocho compuestos pertenecientes a la familia de los 5-NDZs se abordó usando la CEC acoplada a MS. En este método se evaluaron diferentes fases estacionarias, concretamente Lichrospher C18 (5 μm), CogentTM C18 Bidentada (4.2 μm), Pinnacle IITM Phenyl (3 μm), and Pinnacle IITM Cyano (3 μm). Finalmente, en los estudios llevados a cabo mediante CEC-UV, se obtuvo mejor separación cuando se usó la fase estacionaria CogentTM C18 Bidentada (4.2 μm). Para el acoplamiento CEC-MS se empleó una interfase ‘nano’ de unión líquida fabricada en el laboratorio. Por otra parte, el líquido adicional consistió en una mezcla 2-propanol/agua (50:50, v/v) conteniendo ácido fórmico (0.05%, v/v). Considerando las condiciones optimizadas del método CEC-ESI-MS, la separación se llevó a cabo a 15 kV empleando como fase móvil una mezcla 45:10:45 (v/v/v) MeCN/MeOH/agua conteniendo acetato amónico (5 mM, pH 5). Finalmente, la separación se llevó a cabo en 22 minutos en una columna empaquetada con una mezcla 3:1 (m/m) C18 Bidentada (4.2 μm)/Lichrospher Silica-60 (5 μm). Asimismo, la inyección de las muestras se realizó mediante la combinación simultánea de una inyección electrocinética y una inyección hidrodinámica (96 s, 8 bar, 15 kV). El método propuesto se aplicó a muestras de orina dopadas con MNZ, secnidazol (SCZ), y ternidazol (TRZ), las cuales fueron tratadas mediante una extracción SPE, antes de ser analizadas. Además, el espectro de MS2 se obtuvo para cada uno de los antibióticos seleccionados, obteniendo la identificación inequívoca de estos compuestos en las muestras de orina.
La Parte IV consiste en una introducción y dos capítulos que incluyen los métodos basados en la LC y que se han propuesto para la determinación de 5-NDZs. El Capítulo 10 introduce la técnica LC, incidiendo en la miniaturización, especialmente en la CLC, así como en la tecnología UHPLC.
En el Capítulo 11 se discute la optimización de un método de CLC-UV. Se evaluaron los distintos parámetros que afectan a la separación tales como la composición de la fase móvil, el flujo de la fase móvil, la temperatura de separación, el programa de gradiente así como el tipo de columna cromatográfica empleada. Finalmente la separación de once 5-NDZs se llevó a cabo en una columna Zorbax XDB-C18 (150 × 0.5 mm, 5 µm) bajo una temperatura de separación de 20°C, usando una fase móvil constituida por agua como eluyente A y MeCN como eluyente B, y suministrada con un flujo de 7 µL/min. Las señales analíticas se registraron a una longitud de onda de 320 nm. Además, se consideró una inyección de bucle completo (8 µL), en tanto que el disolvente de inyección considerado era agua. El método optimizado se aplicó a la determinación de nueve compuestos 5-NDZs, incluyendo tres metabolitos, en productos de acuicultura, concretamente cangrejo, salmón, gamba y nécora. Se llevó a cabo la evaluación de un procedimiento MISPE, como tratamiento de muestra.
El Capítulo 12 presenta un estudio exhaustivo de los parámetros involucrados en un proceso SALLE para la extracción de ocho antibióticos 5-NDZs en muestras de leche, aplicado antes de su análisis mediante UHPLC-UV. Se consideró el uso de acetato de etilo como disolvente de extracción, en tanto que el Na2SO4 se empleó como agente salino. Después de la aplicación del tratamiento de muestra, el extracto obtenido se reconstituyó en una mezcla MeCN/agua (6:94, v/v) conteniendo ácido fórmico (0.1%, v/v), y posteriormente se analizó mediante un nuevo método UHPLC-UV. Se consideró un volumen de inyección de 20 µL (modo de inyección de bucle completo) y la separación se llevó a cabo en una columna C18 Zorbax Eclipse Plus (50 mm x 2.1 mm, 1.8 µm) en 8 minutos. El flujo de la fase móvil se estableció en 0.45 mL/min y consistía en una disolución acuosa 0.1% (v/v) de ácido fórmico como eluyente A, y MeCN conteniendo 0.1% (v/v) ácido fórmico como eluyente B. Además, la columna se termostatizó a 45 °C durante el análisis y las señales analíticas se monitorizaron a 320 nm.
Además se ha llevado a cabo la determinación de doce compuestos 5-NDZs en huevas de merluza mediante un nuevo método UHPLC-MS/MS desarrollado en el Capítulo 13. En dicho capítulo se propone un tratamiento de muestra rápido, simple, barato y respetuoso con el medio ambiente para la extracción de 5-NDZs, dado que se necesitaron 5 mL de MeCN por muestra para lograr dicho objetivo. La separación se llevó a cabo en una columna C18 Zorbax Eclipse Plus (50 mm × 2.1 mm, 1.8 µm) en menos de 4 minutos. La fase móvil consistía en una disolución acuosa al 0.025% (v/v) en ácido fórmico como eluyente A y MeOH como eluyente B, usando un flujo de 0.5 mL/min. Durante la separación, la temperatura de la columna se mantuvo a 25°C. Además, las muestras se inyectaron en una mezcla 95:5 (v/v) de disolución acuosa de ácido fórmico (0.025%, v/v)/MeOH, siendo el volumen de inyección de 17.5 µL.
