Resumen de Reconstitución de productos Hematopoyéticos Criopreservados: control de calidad, estabilidad osmótica y lavado de DMSO
La logística de un Trasplante de Progenitores Hematopoyéticos (TPH) incluye en la mayoría de casos (TPH autólogo y de Sangre de Cordón Umbilical (SCU)), una etapa de criopreservación a temperaturas de 196ºC. Las técnicas de congelación más extendidas utilizan DMSO como crioprotector para optimizar la viabilidad y funcionalidad de las células reduciendo la proporción de agua congelada y la deshidratación intracelular durante el proceso de congelación.
La presencia del crioprotector hace que las suspensiones celulares descongeladas sean hipertónicas y como las células responden importando y exportando agua frente a un cambio de osmolaridad, el retorno a condiciones isotónicas puede resultar en la superación de los límites mecánicos de las membranas plasmáticas por una entrada masiva de agua al citoplasma (choque osmótico). Este fenómeno es de especial importancia durante la reconstitución y manipulación de células descongeladas debido a que la membrana celular es un conjunto de lípidos y proteínas organizados que por debajo de los 20ºC pierde fluidez, limitando su resistencia y por tanto su capacidad de respuesta osmótica.
En 1978, el profesor John Goldman95 publicó las primeras evidencias del fenómeno de choque osmótico sobre la reducción de capacidad clonogénica en médula ósea (MO) descongelada. Sin embargo, este trabajo no ha tenido una gran repercusión en los protocolos de criopreservación seguramente porque el número de Células Progenitoras Hematopoyéticas (CPH) en MO y en Aféresis (CPH-A) está por encima del umbral mínimo definido para uso clínico. Esta situación cambia en el momento que la SCU se define como fuente de células progenitoras debido a su limitada proporción en estos productos. Así, en 1995 el Dr. Pablo Rubinstein139 reabre el debate de la relevancia del choque osmótico en productos hematopoyéticos descongelados e introduce la estabilidad osmótica previa a la infusión para reducir el efecto del cambio brusco de osmolaridad durante el retorno a condiciones isotónicas.
Para la práctica diaria de un laboratorio de procesamiento celular, y por extensión para el equipo clínico de trasplante, el choque osmótico afecta a los controles de calidad del descongelado si estos incluyen manipulaciones que impliquen cambios bruscos de osmolaridad. En este sentido, un caso muy llamativo es el de la citometría de flujo (CMF), no en vano, casi ningún laboratorio realiza este tipo de análisis en muestras descongeladas debido seguramente a la falta de correlación con los datos precongelación.
Más alarmante es el hecho de que la infusión directa de los inóculos descongelados pueda ser también una fuente de choque osmótico que comprometa la viabilidad celular resultando, en el caso de TPH con dosis límite de CPH, determinante para el éxito de la recuperación hematopoyética.
En este ámbito se ha desarrollado el trabajo experimental de esta Tesis Doctoral que proporciona evidencias, cuantifica el efecto del choque osmótico en los controles de calidad de productos hematopoyéticos descongelados, propone un método de CMF para su análisis y valida dos sistemas automáticos aptos para la clínica que rinden productos estabilizados osmóticamente, listos para trasplante y sin pérdida celular ni de viabilidad significativas.
_________________________________________________ Current logistics of Hemopoetic Progenitor Cells Transplant (HPT) usually includes (Autologous HPT and Umbilical Cord Blood Cells (UCB) Transplant) a cryopreservation step at temperatures of 196ºC. Dimethyl sulfoxide, the most used cryoprotector raises cellular viability and function both by reducing frozen water proportion as well as intracellular dehydration during the freezing process of cells.
Presence of cryoprotector makes thawed cellular suspension hypertonic and as cells respond importing and exporting water from their cytoplasm in front of changes of osmolarity, the return to isotonic conditions may surpass the mechanical limits of plasmatic membranes by means of a massive entry of water into the cytoplasm (osmotic shock).This is specially important during the reconstitution and manipulation of thawed cells because cell membrane is a set of organized lipids and proteins that below of 20ºC loose fluidity thus limiting resistance and so capacity of response in front of an osmotic shock.
In 1978, first evidences about the reduced clonogenicity in thawed cells from Bone Marrow (BM) were published by professor John Goldman. However, these results have not had great repercussion on cryopreservation protocols possibly because the huge number of progenitor cells in BM and Apheresis (HPC-A). This situation changes when UCB is defined as a suitable source of progenitor cells due to the limited number of cells in these products. In this regard, Dr. Pablo Rubinstein reopens in 1995 the debate about the relevance of osmotic shock in thawed progenitor cells grafts. In that work, osmotic stability before infusion was introduced to reduce deleterious effect of sudden changes in osmolarity during the return to isotonic conditions.
Considering Cell Processing laboratories current practices, osmotic shock concerns quality controls of thawed cells when sudden changes in osmolarity are included in these techniques. It is specially relevant when Flow Cytometry is considered because almost no laboratory uses this technique to analyze thawed samples because of the lack of correlation with pre freeze data.
In addition, direct infusion of thawed grafts could be a source of osmotic shock altering cells viability which, in case of limiting number of progenitor cells in the graft, could affect hemopoètic recovery of the transplanted patient.
In this field has been developed the experimental of the present Doctoral Thesis which provides evidences and quantify the effect of the osmotic shock in quality controls of thawed hemopoetic grafts as well as proposes a method of Flow Cytometry to analyze them. Finally, in this work two automatic systems available for the clinic were validated to wash DMSO and producing osmotically stabilized products without significant looses of viability and progenitor cells.
