Resumen de Aproximación proteómica al estudio del estrés nitrosativo en varios modelos experimentales de lesión hepatocelular
La S-nitrosilación es una modificación postraduccional que podría jugar un importante papel en distintas patologías. En el hígado se ha demostrado tanto un efecto citotóxico como citoprotector para el óxido nítrico (NO), y la S-nitrosilación de proteínas puede estar implicada en algunos de los mecanismos responsables de este doble papel. El objetivo del presente estudio fue determinar el papel del estrés nitrosativo intracelular e identificar mediante una aproximación proteómica las posibles proteínas S-nitrosiladas en la muerte celular inducida por el hepatotóxico DGalactosamina o por la alteración de la homeostasis de S-nitrosotioles (SNO) en hepatocitos humanos, y en la lesión hepatocelular durante colestasis experimental en ratas y su citoprotección por ácido ursodesoxicólico conjugado con taurina (TUDCA) o por el inhibidor de la síntesis de NO, Smetilisotiourea (SMT). Métodos: La necrosis y apoptosis se valoraron mediante la liberación de LDH y fragmentación de DNA, respectivamente. El NO se determinó midiendo nitrito y nitrato en el medio de cultivo de los hepatocitos o en el plasma de ratas. Los niveles celulares de nitrosotioles se determinaron mediante quimioluminiscencia, la actividad nitrosoglutatión reductasa (GSNOR) se determinó espectrofotométricamente y los niveles de ARNm del gen ADH5 (GSNOR) se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real. Las proteínas nitrosiladas se marcaron utilizando el método "biotin-switch", se detectaron con un anticuerpo anti-biotina y se purificaron con estreptavidinaagarosa.
Se identificaron mediante digestión con tripsina, desionización en matriz asistida por láser y tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o mediante ionización con electroespray y espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS). Resultados y Conclusiones: Los resultados señalan la importancia de la homeostasis de SNO en varios modelos experimentales de lesión hepatocelular. La elevación de los niveles celulares de SNO, observada en hepatocitos humanos tratados con un hepatotóxico o en condiciones de estrés nitrosativo, se vio acompañada de una alteración de los parámetros de muerte celular. Además, se observó un control preciso del contenido celular de SNO cuando en los hepatocitos humanos se indujeron elevados niveles de S-nitrosoproteínas. Las enzimas GSNOR y tioredoxina reductasa jugaron un papel importante en este mantenimiento de la homeostasis de los S-nitrosotioles y por tanto en la defensa frente al estrés nitrosativo en el hepatocito. Se demostró también como el estrés nitrosativo juega un papel clave en un modelo de colestasis experimental. Además, el beneficio terapéutico de un inhibidor de la síntesis de NO demostró ejercer su efecto hepatoprotector a través de un restablecimiento parcial de la homeostasis de SNO. Finalmente, la aproximación proteómica utilizada permitió la identificación de varias S-nitrosoproteínas, entre las que se encontraron proteínas participantes en el metabolismo, en la preservación del estado redox y en la homeostasis celular. Estos resultados proporcionan nuevos objetivos para futuras investigaciones, que sin duda facilitarán la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de nuevos tratamientos para distintas dolencias hepáticas.
