Interacción entre la hepatitis C y el metabolismo lipídico: Una oportunidad terapeútica
- Autores: María Ángeles Rojas Álvarez Ossorio
- Directores de la Tesis: José Antonio del Campo (dir. tes.), Manuel Romero-Gómez (dir. tes.), José Villar Ortiz (tut. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Bautista Palomas (presid.), Jerónimo Pachón Díaz (secret.), Xavier Forns Bernhardt (voc.), Sophie Clement Leboube (voc.), José Luis Calleja Panero (voc.)
- Materias:
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- Resumen
1. INTRODUCCIÓN La hepatitis crónica C es un foco de interés de considerable importancia para los diferentes campos que abarcan la investigación. Se estima que a nivel mundial existen alrededor de 170 millones de personas (3% de la población global) infectadas por el virus de la hepatitis C (VHC) siendo esta patología, la causa más frecuente del desarrollo de cirrosis y hepatocarcinoma. Ante la baja tasa de respuesta viral sostenida (RVS) que se alcanza tras la doble terapia (45%), surge la idea de buscar factores predictivos de respuesta. Estudios de asociación genómica, (del inglés, genome-wide association study, GWAS) han hallado el SNP (Single Nucleotide Polymorphism) de la IL28B, rs12979860 (C >T), 19q13 (Ge y cols., 2009). La variante alélica CC, conlleva a la posibilidad de alcanzar respuesta, respecto al polimorfismo CT, pero siguen existiendo pacientes con el genotipo favorable cuya respuesta al tratamiento no es la esperada.
El uso de replicones subgenómicos (Wakita y cols., 2005; Bartenschlager y Pietschmann., 2005), ha permitido conocer las interacciones de los componentes virales con la célula hospedadora. El VHC, está asociado al metabolismo lipídico, y circula en plasma unido a las lipoproteínas en forma de lipoviropartícula (André y cols., 2002). Esta asociación con las lipoproteínas parece tener una importante significancia biológica, permitiendo ocultar el virus frente al sistema inmune. Los lipid droplets (LD) o gotas lipídicas, son pequeñas organelas citoplasmáticas, constituidas por un núcleo hidrofóbico de triglicéridos (TG) y esteres de colesterol, cuya función principal es el almacenaje de lípidos. En 2011, (Meester y cols., 2011) se les atribuye un papel esencial en el ciclo de vida de diversos patógenos, siendo el caso del VHC. El VHC requiere de los LDs para formar la partícula viral infecciosa. DGAT-1 aparte de estar implicada en la síntesis de TG y de los LDs, es esencial para que se produzca la traslocación de la proteína viral core hacia el LD (Herker y cols., 2010). Este grupo utilizo un inhibidor directo de DGAT1 y observó una disminución de los niveles de ARN corroborando la importancia de esta proteína en el ciclo de vida.
Considerando esta enzima una posible nueva diana para el tratamiento de la hepatitis C, realizamos una búsqueda de inhibidores naturales de esta enzima. La quercetina es un flavonoide natural, que se localiza en variedad de alimentos. Aparte de su acción inhibitoria sobre DGAT (Gnoni y cols., 2009), la quercetina modula diferentes proteínas del metabolismo lipídico y altera la funcionalidad de las proteínas virales NS3 y NS5A (Bachmetov y cols., 2012; Khachatoorian y cols., 2012) esenciales en la replicación viral.
2. OBJETIVOS 1. Analizar la asociación del metabolismo lipídico y la infección crónica por el vi-rus de la hepatitis C, tanto en una cohorte de pacientes como en un sistema in vitro.
2. Búsqueda de nuevas dianas terapéuticas en la vía lipídica del hospedador para el tratamiento de la hepatitis C: Papel de la diacilglicerol aciltransferasa-1.
3. Análisis de la inhibición de DGAT por el flavonoide quercetina y su efecto en el ciclo de vida del virus de la hepatitis crónica C.
3. MATERIAL Y MÉTODOS Se ha analizado el polimorfismo rs12979860 del gen de la IL28B en 2175 individuos, 1384 pacientes con hepatitis crónica C y 791 controles sanos de la población general española. Este análisis se ha analizado mediante rt-PCR acoplada a transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET). Los distintos genotipos se han clasificado en tres grupos (CC, CT vs TT) y los niveles de colesterol total, LDL, VLDL y HDL se analizaron mediante Hitachi en el laboratorio de rutina. En las líneas celulares Huh-7.5 y Huh-7 transfectadas por replicones subgenómicos y en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se analizaron los niveles de expresión de diferentes genes implicados en el metabolismo lipídico mediante rt-PCR.
Para estudiar el efecto de la quercetina (50µM) en el ciclo viral, las células Huh-7 y Huh-7.5 fueron infectadas con Jc1 y JFH1 (1 partícula/célula) y tratadas con quercetina. Los niveles de expresión de DGAT1 fueron analizados por rt-PCR y por inmunoblot los niveles de proteínas virales y del metabolismo lipídico.
La morfología de los LDs y la localización de core fueron estudiados por técnicas de imagen con microscopia confocal en células Huh-7, transducidas con lentivectores que expresaban core del genotipo 3a, e infectadas por Jc1 en presencia o no de quercetina.
4. RESULTADOS El genotipo CC se asoció con niveles elevados de LDL en suero, en presencia del genotipo 1: CC = 110,2 ± 37,9 mg/dl; CT= 96,8 ± 30,7 mg/dl, TT= 88,7 ± 28,3 mg/dl (p= 0,005), pero no se encontraron diferencias en los niveles de HDL. Esta asociación de los niveles de LDL en suero, no se observo en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 3 y 4 ni en la población control. La prevalencia del genotipo CC del polimorfismo de la IL28B fue de El genotipo CC de la IL28B estaba fuertemente asociado con la RVS: genotipo CC: 328/457 (71,7%); genotipo CT: 311/716 (43,4%) y genotipo TT: 76/219 (34,7%)( p= 0,0001). Además, el genotipo CC estaba más presente en pacientes infectados por genotipo 3 (54,5%) y población no infectada and (50,3%), que en pacientes infectados por el genotipo 1 (29,8%) y 4 (30%); p = 0,0001.
En las Huh-7.5 transfectadas por JFH1 y en PBMC de pacientes no respondedores, los niveles de expresión de DGAT1 estaban incrementados. La actividad de DGAT incrementa en células Huh-7.5 (CT) y Huh-7 (CC) transfectadas por JFH1, independientemente del genotipo de la IL28B. La expresión de DGAT-1 a las 48h de tratamiento e infección (Huh7: 1±0,07; Huh7+Quercetina 50µM: 0,5±0,2; Jc1: 0,99±0,3; Jc1+Quercetina 50µM: 0,55±0,1) y tras 72h (Huh7: 1±0,03; Huh7+ Quercetina 50µM: 0,7±0,3; Jc1: 0,7±0,3 Jc1+Quercetina 50µM: 0,06±0,2) esta disminuida de forma significativa, al igual que los niveles de proteína de core, NS3, MTP, FAN y DGAT1.
La quercetina a dosis 50¿M, disminuye significativamente los niveles de ARN viral en un 21%, en células infectadas por Jc1 y también cuando las células son infectadas por JFH1 donde se observa una disminución de un 52,58% cuando lo comparamos con células tratadas con interferon (0% de ARN viral).
El área, radio y volumen de los LDs, así como su distribución fueron modulados por el tratamiento con quercetina. La quercetina evita el aumento del tamaño de los LDs inducido por la proteína core del genotipo 3a en las células Huh7[LD área (¿m2): 3a:109,8±33,72; 3aQ50µM:79,90±36 (p<0,001); 3aQ100µM:72,6±35,4 (p<0,0003); radio (¿m): 3a:5,85±0,88; 3aQ50µM:4,91±1,15 (p<0,001); 3aQ100µM:74,65±1,22 (p<0,0002), volumen (¿m3): 3a:894,7±418,5; 3aQ50µM:577,03±379,26 (p<0,003); 3aQ100µM:505,4±355,2 (p<0,0006)]. En estas células, core se localiza alrededor de los LDs, siendo ésta inhibida en presencia de quercetina: core aparece dispersa por el citoplasma.
5. CONCLUSIONES 1. Existe asociación entre la infección crónica del virus de la hepatitis C y el metabolismo lipídico.
2. Los niveles de LDL séricos se encuentran incrementados en presencia del genotipo CC de la IL28B en pacientes infectados con el genotipo 1.
3. Los niveles de expresión de DGAT1 y la actividad de DGAT, se incrementan ante la presencia del virus de la hepatitis C.
4. La quercetina modula los niveles de expresión de genes y proteínas relacionadas con el metabolismo lipídico, exista o no infección; en concreto la diacilglicerol aciltransferasa 1.
5. Los niveles de replicación y ARN viral son menores tras el tratamiento con quercetina.
6. La quercetina disminuye el tamaño de los lipid droplets exista o no infección.
7. La co-localización de core con los lipid droplets es interrumpida por la quercetina.
La infección crónica por el virus de la hepatitis C requiere del metabolismo lipídico para completar su ciclo de vida siendo la actividad de DGAT y los lipid droplets esenciales en la etapa de ensamblaje. La quercetina modula el metabolismo lipídico, disminuye el tamaño de los lipid droplets e interfiere en la replicación viral disminuyendo los niveles de ARN e impidiendo la localización de core con la superficie de los lipid droplets. Este flavonoide podría ser útil para el tratamiento de la hepatitis C crónica así como de la esteatosis hepática mediante suplementos de quercetina en la dieta junto a cambios en el estilo de vida y el ejercicio físico.
