Producció de Fuculosa-1-Fosfat aldolasa recombinant en E.coli

• Autores: Olga Durany Türk
• Directores de la Tesis: Carles de Mas Rocabayera (dir. tes.), Josep López Santín (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2005
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Carles Solà i Ferrando (presid.), Francisco Balero (secret.), Antoni Plans (voc.), Francois-Xavier Berthet (voc.), Eduardo García Junceda (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen

  • En lactualitat es coneix un gran ventall denzims naturals capaços de catalitzar la formació denllaços caboni-carboni amb estereoquímica definida que obren noves perspectives en el camp de la síntesi asimètrica aportant solucions sintètiques en camps difícils dabordar des de la perspectiva de la síntesi orgànica convencional. Aquests enzims són bàsicament aldolases i transcetolases. En concret es coneix una família de quatre aldolases depenents de DHAP que catalitzen la formació dun enllaç C-C amb generació de dos nous centres quirals amb estereoquímica definida i complementària: segons laldolasa utilitzada sobtindrà de forma específica un dels quatre diaestereoisòmers possibles. Aquesta família daldolases ha despertat un gran interès com a eina sintètica.

    El projecte en que semmarca aquesta tesi aposta per lestudi daquest grup de biocatalitzadors i pretén contribuir al desenvolupament pràctic de les aldolases centrant-se en els aspectes de producció dels enzims i en el desenvolupament de metodologia per a la seva utilització en síntesi quiral.

    En aquesta memòria de tesi doctoral sestudia la millora de producció de laldolasa Fuc-1-PA en E.coli, com enzim model daquesta família daldolases depenents de DHAP. Lobjectiu és definir un procés optimitzat i reproduïble per a la seva obtenció a escala productiva. Amb aquest objectiu global, es consideren els principals aspectes que condicionen la sobreexpressió de proteïnes recombinants E.coli. Primer, sestudia la influència de la composició del medi de cultiu en el creixement i sobreexpressió recombinant. Segon, es treballa en el desenvolupament duna estratègia de cultiu semicontínua adequada per assolir cultius dalta densitat cel.lular de forma reproduïble. Un cop fixades les condicions doperació per al creixement segons aquesta estratègia semicontínua, és possible definir els criteris dinducció per maximitzar la producció de Fuc-1-PA al procés. Finalment, saborda la millora genètica del procés provant un nou sistema dexpressió recombinant desenvolupat pensant en la seva aplicació a escala de producció.

    _________________________________________________ Nowadays, a considerable number of wild-type enzymes catalazing formation of stereo chemically defined C-C bond as natural function have been discovered. These enzymes have opened new possibilities in quiral chemistry field as they could mean a solution for problems impossible to be solved right now with conventional organic chemistry alternatives. These enzymes are, basically, aldolases and transketolases. It is important to point here out that it is known a four members DHAP dependent aldolases family which is able to catalyze the formation of a new C-C bond which results in the formation of two new quiral centers with complementary and perfectly defined stereochemistry. Hanging on the aldolase employed in the new C-C bond synthesis it is obtained specifically one of the four possibles diastereoysomers. This family has been considered really interesting as synthetic tool.

    The project this thesis work is related to, is focused on the study of these biocatalyzers group and its main goal is the practical knowledge of aldolases: learn new techniques for maximize their production and make it possible their final application as quiral synthetic tools.

    In this work, improvements in Fuculose-1-phosphate aldolase production are studied, as enzyme model of this four members family. The final goal fixed for this work is define a optimizated and reproducible process for its production at industrial scale. To obtain this final goal, here are studied the most important points affecting recombinant proteins production in E. coli. First, study of growth media composition influence in growth and recombinant overexpression. Second, search of a new semi-continues fermentation strategy which allows obtain high cell density cultures in a reproducible way. Once, growth conditions have been fixed related to this new semi continues fermentation strategy, it is possible to work on induction criteria definition in order to maximize Fuc-1-FA production. Finally, work has been focused on genetic improvement of the process. We have tested a new recombinant expression system for industrial scale application: ORT expression System.