Papel del Cdc7 en la regulación de la recombinación homóloga durante la tolerancia a daños replicativos
- Autores: María José Cabello Lobato
- Directores de la Tesis: Félix Prado Velasco (dir. tes.), Ralf Erik Wellinger (tut. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Número de páginas: 113
- Tribunal Calificador de la Tesis: Andrés Avelino Bueno Núñez (presid.), José Francisco Ruiz Pérez (secret.), José Antonio Tercero Orduña (voc.), Juan Méndez Zunzunegui (voc.), Belén Gómez González (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
La tolerancia a daños en el ADN (DDT, DNA damage tolerance) es una compleja red de mecanismos que facilita el avance de las horquillas replicativas sobre lesiones que las bloquean y promueve la reparación de los fragmentos de ADN de cadena sencilla (ssDNA) generados durante este proceso. Debido a la importancia de estos mecanismos en el mantenimiento de la estabilidad genómica, la DDT debe estar altamente regulada y mutaciones en muchos de sus componentes están asociados al cáncer y enfermedades genéticas.
Uno de los principales mecanismos de DDT es la recombinación homóloga (HR), que usa la información de las cromátidas hermanas intactas para facilitar el avance de las horquillas y reparar las lesiones de ssDNA, favoreciendo por tanto una reparación libre de errores. Las proteínas de recombinación homóloga Rad51 y Rad52 viajan con la horquilla replicativa facilitando la progresión y son posteriormente cargadas en las lesiones de ssDNA. Sin embargo, a pesar de que estas proteínas están unidas a los fragmentos de ssDNA durante la fase S, el relleno de estos huecos no se produce hasta que la replicación se ha completado. Las funciones replicativas (fase S) y reparacionales (fases G2/M) de la HR están acopladas mecanísticamente, de manera que la restricción de la expresión de Rad52 a G2/M impide la unión de Rad51 al ssDNA, la formación de SCJs y focos de reparación, y la reparación de los huecos de ssDNA. Nuestra hipótesis es que la carga de Rad52 y Rad51 a los daños replicativos está acoplada al avance de la horquilla de replicación, lo que marcaría una diferencia substancial con la reparación de DSBs por HR, donde el reclutamiento es independiente de replicación.
El objetivo principal de este proyecto ha sido estudiar los mecanismos de unión de las proteínas de HR a los daños replicativos durante la DDT utilizando como organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. En concreto, hemos estudiado el papel de DDK (Dbf4 dependent quinase, Cdc7 en S. cerevisiae) en la regulación de las proteínas de HR durante la tolerancia a daños replicativos. La actividad quinasa de Cdc7 es esencial para la iniciación de la replicación a través de la fosforilación de la helicasa MCM2-7. Cdc7 también participa en síntesis trans-lesión (TLS) a través de un mecanismo independiente de su función en la replicación del ADN. Además de sus papeles en iniciación de la replicación y TLS, Cdc7 actúa como mediador y diana del checkpoint replicativo. En esta tesis hemos demostrado que las proteínas de recombinación Rad51 y Rad52 interaccionan físicamente con la helicasa MCM2-7. Además, Rad51, Rad52 y MCM2-7 muestran cinéticas de unión a la cromatina similares durante el ciclo celular: se acumulan en G1, se liberan de la cromatina conforme la fase S progresa, y en presencia de daño se mantienen durante S/G2. La actividad quinasa de Cdc7 es necesaria para la integridad del complejo, y éste, a su vez, para la carga de Rad51, Rad52 y MCM2-7 a las lesiones de ssDNA generadas durante la replicación del ADN alquilado. En consecuencia, células defectivas en actividad de DDK presentan defectos en reparación recombinacional del daño replicativo inducido por el agente alquilante metil metano sulfonato (MMS). Estos resultados señalan a MCM2-7 como una plataforma molecular mediante la cual Cdc7 promueve la unión a las lesiones de ssDNA de proteínas Rad51 y Rad52 pre-cargadas en la cromatina en G1. Esta estrategia facilita la reparación libre de errores como primera opción frente a otras vías mutagénicas.
De manera paralela, hemos estudiado el papel del reciclaje de histonas por ensambladores de cromatina en la respuesta a daños replicativos. En particular, hemos estudiado el papel de Asf1, una chaperona de histonas necesaria para el ensamblaje de la cromatina durante la replicación y la reparación del ADN, funciones que realiza en coordinación con la helicasa MCM2-7 y el complejo FACT. Nuestros resultados muestran que Asf1, mediante un mecanismo independiente de su función como chaperona de histonas, regula la unión de Rad52 a las lesiones en el ADN inducidas por MMS. Este papel es también independiente del complejo que forma con Rad53, aunque Rad53 también regula la unión de Rad52 al daño replicativo mediante una función independiente a su papel en el checkpoint.
