Identificació immunològica i caracterització de les propietats biològiques de la proteïna catiònica deosinòfil

• Autores: Ester Carreras Margalef
• Directores de la Tesis: M. Victòria Noguès i Bara (dir. tes.), Ester Boix i Borràs (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2004
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Emili Itarte (presid.), Mohammed Moussaoui (secret.), Dolors Fondevila (voc.), Maria Vilanova Brugués (voc.), Marc Ribó Panosa (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen

  • La proteïna catiònica deosinòfil (ECP) és una ribonucleasa que es troba als grànuls secundaris dels eosinòfils. Els nivells dECP en fluids corporals sutilitza com a indicador del número i activació dels eosinòfils. LECP és tòxica per diversos patògens com són bacteris, paràsits, virus i per cèl·lules de mamífer.

    Per identificar immunològicament lECP sha seleccionat una regió específica de la proteïna (D112-P123) com a possible epítop antigènic. La regió D112-P123 no es troba en lRNasa A, 1, 4 i 5 i és on sobserva una màxima desviació de lesquelet de la cadena principal de lECP i la neurotoxina derivada deosinòfil (EDN) amb la qual comparteix un 67% didentitat de seqüència. Shan immunitzat conills amb un pèptid sintètic (D112-P123) conjugat a una proteïna transportadora i shan purificat els anticossos policlonals amb una columna dafinitat amb lECP immobilitzada.

    Lanticòs D112-P123 reconeix específicament lECP en condicions reductores i no reductores i no presenta reactivitat creuada amb lEDN, lRNasa A i altres proteïnes control. La immunodetecció per transferència Western amb lanticòs D112-P123 ha mostrat que hi ha una relació lineal entre la quantitat de proteïna (1-75 ng) i el senyal obtingut. Sha assajat la reactivitat de lanticòs D112-P123 en fluids corporals i granulòcits. Lanticòs D112-P123 detecta la forma nadiua no glicosilada i les formes glicosilades de lECP en granulòcits, esput i plasma. Sha obtingut una bona correlació entre els nivells dECP determinants amb lanticòs D112-P123 i amb un anticòs que comercialitza Pharmacia & Upjohn (Uppsala, Suècia).

    Per estudiar la relació entre lestructura i les activitats biològiques de lECP shan obtingut variants de la proteïna en residus específics de lECP. Shan escollit residus catiònics i aromàtics exposats en la superfície de la proteïna (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A, R101A/R104A) i de la regió del loop D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP i (115-122 EDN) ECP .

    Sha estudiat lefecte de lECP i les seves variants en lactivitat ribonucleasa, la disrupció de membranes, la citotoxicitat per bacteris gramnegatius i grampositius i linhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. També sha realitzat una predicció de lestructura tridimensional dels mutants per modelatge molecular.

    Les variants de lECP no modifiquen substancialment ni lestructura tridimensional de la proteïna ni lactivitat ribonucleasa.

    Lactivitat sobre membranes de lECP i les seves variants sha analitzat utilitzant vesícules sintètiques. LECP mostra una clara preferència per desestabilitzar vesícules acídiques resultat que suggereix que les càrregues positives de la proteïna són importants per la interacció amb les membranes. Lestudi de lefecte de les mutacions en lactivitat sobre les membranes ha mostrat que aminoàcids catiònics específics i els triptòfans de la proteïna (W10, W35R36 i R101R104) estan relacionats amb la desestabilitazació de la membrana.

    Aquests resultats correlacionen bé amb lefecte dels mutants en la inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. Les regions W35R36 i W10 són essencials per la inhibició de la proliferació. Altres residus catiònics i aromàtics R75F76, R101R104, Y122 tenen un paper secundari en linhibició del creixement que es pot explicar per la possible interacció daquests residus amb els carbohidrats de la superfície de les cèl·lules de mamífer.

    La regió W35R36 té un paper essencial en lactivitat bactericida per grampositius i gramnegatius. Els altres residus estudiats tenen efectes diferents en lactivitat bactericida de lECP depenent es tracti d E. coli o S. aureus. Mentre els residus R101R104 i R75F76 són importants per lactivitat bactericida sobre E. coli, els residus W10 i la regió del bucle D115-Y122 són necessaris per lactivitat bactericida sobre S. aureus.

    Podem concloure que les regions catiòniques i hidrofòbiques estudiades participen en la capacitat de lECP per desestabilitzar membranes biològiques i/o en la interacció de la proteïna amb components de la paret bacteriana o amb els carbohidrats de la superfície de cèl·lules de mamífer.

    Eosinophil cationic protein (ECP) is a ribonuclease located in the secondary granules of eosinophils. ECP levels in body fluids are used as an indicator of number and activation of eosionophils. ECP is toxic for many pathogens including bacteria, parasites, virus and for mammalian cells.

    To identify ECP we have selected a specific loop region of the protein (D112-P123) as a putative antigenic epitope. This sequence is absent in RNase A, 1, 4 and 5 and the polypeptide main chain adopts a specific conformation in ECP and also in eosinophil-derived neurotoxin (EDN) which shares 67 % sequence homology with ECP. A synthetic peptide containing the sequence and linked to a carrier protein was used to obtain rabbit polyclonal antibodies which were further purified by an affinity column with ECP as a ligand.

    D112-P123 antibody specifically recognizes ECP in reducing and nonreducing conditions and does not cross-react with EDN, RNase A or other control proteins. The immunodetection of recombinant ECP by Western blot has shown a lineal relationship between the quantity of protein (1-75 ng) and the signal obtained. The reactivity of the antibody was assayed in different body fluids and granulocytes. D112-P123 antibody detects the glycosylated and nonglycosylated forms of the native ECP in granulocytes, plasma and sputum. A good correlation has been obtained between ECP levels determined by the antibody D112-P123 and by an antibody obtained from a commercial source.

    To study the relationship between the structure and biological activities of ECP we have obtained variants of the protein in specific amino acids residues. We have chosen cationic and aromatic amino acids located at the protein surface (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A and R101A/R104A) and in the loop region D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP and (115-122 EDN) ECP.

    For the wild type form and mutants we have determined the ribonuclease and membrane-lytic activity, the cytotoxicity for gram negative and gram positive bacteria and the mammalian cell growth inhibition. The three dimensional structure of ECP mutants has been predicted by molecular modelling.

    ECP variants do not show important changes neither on the three dimensional folding nor on the ribonuclease activity of the protein.

    The lytic-activity of ECP and mutants on cell membranes has been analysed using synthetic lipid vesicles. ECP shows a notable preference to destabilize acidic liposomes which suggests that the electrostatic interaction between membrane and the protein are important for protein binding. The study of the effect of the mutations in the membrane-lytic activity has shown that specific arginine residues and the two tryptophan residues of the protein (W10, W35R36 and R101R104) are related to the membrane destabilization.

    This results correlate well with the effect of the mutants in the mammalian cell growth inhibition. W35R36 and W10 are essentials for the inhibition of proliferation while other cationic and aromatic residues, R75F76, R101R104 and Y122, play a secondary role which might be explained for the possible interactions of these residues with the carbohydrates on the surface of mammalian cells.

    W35R36 are essentials for the bactericidal activity for gram positive and negative bacteria. Other amino acid residues have different effects depending on the bacterial strain E. coli or S. aureus. While R101R104 and R75F76 are necessary for the bactericidal activity for E. coli the W10 residue and the loop region D115-Y122 are necessaries for the cytotoxic activity for S. aureus.

    We can conclude from the studied ECP mutants that specific cationic and hydrophobic residues studied participate on the ability of the protein to destabilize biological membranes and/or in the interaction of the protein with components of the bacterial cell wall or the surface of mammalian cells.