Resumen de Papel del oxido nitrico en la supervivencia y funcionalidad de la celula beta durante la insulitis en un modelo animal de diabetes autoinmune. Estudio de su mecanismo de acción
Durante en transcurso de la Diabetes Mellitus tipo1 (DM1), los individuos experimentan una serie de anomalias inmunológicas, de origen desconocido, en las que el sistema inmune se activa frente a la célula beta pancreática en un estadio conocido como insulitis, previo al debut en la enfermedad. Este estadio autoinmune, provoca la activacion de linfocitos T y reclutamiento al pancreas con participacion de macrófagos y celulas dendriticas que inducen muerte a la celula beta pancreatica, principalmente por apoptosis, bien de forma directa o por liberacion de citoquinas proinflamatorias. El mecanismo por el cual las citoquinas proinflamatorias inducen apoptosis a la celula beta está ampliamente estudiado, y mediado en gran parte por la molécula de óxido nítrico.
Además, nuestro grupo ha podido observar un efecto antiproliferativo de las citoquinas proinflamatorias sobre el islote pancreatico cultivado ex vivo e in vivo en la rata BB, la cual debuta espontaneamente en diabetes sobre las 10 semanas de vida, donde observamos descenso en proliferacion de la celula beta pancreatica en estadios muy tempranos de la insulitis, y antes de que comience la apoptosis de la célula beta. Por tanto, consideramos ese mecanismo, un punto clave donde enfocar nuestra investigación ya que, de poderse evitar o revertir ese descenso en proliferación, seria probable que la muerte de la celula beta pudiese atrasarse en el proceso autoinmune, y alargar asi al máximo posible la vida y funcionalidad del islote pancreático, atrasando la aparición de la enfermedad.
En cuanto nuestros experimentos previos ex vivo con islotes pancreátivos, estos muestran que el óxido nítrico (NO) es mediador,al menos en parte, de la respuesta antiproliferativa que los islotes muestran cuando son expuestos a citoquinas proinflamatorias TNFalfa, IL1beta e INFgamma, ya que al tratar los islotes con un inhibidor de la sintesis de NO, la respuesta antiproliferativa que muestran tras exposición a citoquinas revierte.
Este efecto citostatico del NO esta asociada a altas concentraciones y tiene lugar a traves de diversos mecanismos moleculares.
Por otra parte hay varias isoformas de síntesis de NO: la iNOS (NOS2), que es la única inducible, ha sido considerada clasicamente responsable de la destrucción de la celula beta durante la insulitis en DM1. La eNOS (NOS3) y la nNOS(NOS1) son constitutivas y dependientes de calcio y no han sido relacionadas de modo directo con la muerte de la celula beta en DM1.
En los objetivos de esta tesis, nos dispusimos a estudiar qué isoformas de sintesis de NO eran las responsables de esta respuesta antiproliferativa. Además, evaluamos los mecanismos moleculares implicados en esta respuesta tales como el estado de activación de diversas proteinas relacionadas con supervivencia y proliferacion (MAPK y AKT) o niveles de expresión de ciclina D2. Por otra parte, estudiamos los posibles modificaciones post-traduccionales ejercidas por NO que pudian ocurrir en nuestro sistema. Paralelamente a este estudio, pusimos a punto un ensayo in vivo, donde tratamos ratas BB (caracterizadas por debutar en diabetes autoinmune entre las 9 y 11 semanas de vida) con el inhibidor general de la sintesis de NO, LNMMA, desde etapas precoces de la insulitis para hacer una valoración de la funcionalidad e histomorfometria, entre otros parámetros, de los islotes pancreaticos en los animales tratados con LNMMA y los tratados con vehículo.
En los resultados, mostramos la implicacion de las distintas isoformas de sintesis de NO en la respuesta antiproliferativa que los islotes y lineas de insulinoma muestran en nuestro ambiente diabetogenico (en presencia de citoquinas proinflamatorias). Asi, concluimos que las isoformas iNOS y eNOS son las principales responsables del descenso en proliferacion que los islotes y las lineas de insulinoma muestran en presencia de citoquinas proinflamatorias. Además mostramos cómo, en este contexto, ocurre un descenso de la expresión de la proteina de ciclo celular ciclina D2, asic omo otro descenso en activacion de proteínas relacionadas con proliferacion y supervivencia (MAPK ERK y AKT). En cuanto a modificaciones postraduccionales, en este caso vemos clara una nitrosilacion de la proteina AKT. Además, en el ensayo in vivo mostramos, entre otros parámetros, cómo la masa de células beta de islotes de ratas BB tratadas diariamente con el compuesto LNMMA se mantiene conservada conforme progresa la insulitis previa al debut en diabetes, por contra de lo que sucede en animales tratados con vehiculo, donde la masa de celulas beta disminuye normalmente, como es propio de la evolución tipica de la insulitis.
