Caracterización del complejo snare en células plasmáticas humanas: implicación en la secreción de inmunoglobulinas
- Autores: María Laura Gómez Jaramillo
- Directores de la Tesis: Antonio Campos Caro (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cádiz ( España ) en 2014
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Mª del Carmen Rodríguez Hernández (presid.), Francisco Jose Garcia-Cozar (secret.), Sabine Nicole Navarro Hilfiker (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Las células plasmáticas (CPs), con una alta tasa de síntesis y secreción de inmunoglobulinas (Igs), responsables de la inmunidad humoral, son células secretoras por excelencia. Para ello presentan una maquinaria exocítica desarrollada con una importante tasa de fusión de membranas, entre las procedentes de las vesículas que transportan las Igs desde el Golgi y la membrana citoplasmática donde se fusionan para verter el contenido al exterior celular. Entre la maquinaria proteica esencial encargada de la fusión de membranas están las proteínas SNARE (¿Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor-Attachment protein REceptor¿). Se dividen en tres familias ((Sintaxinas (STXs), Sinaptobrevinas (VAMPs) y SNAP25)) y todas ellas se caracterizan por poseer un segmento con estructura en ¿-hélice (motivo SNARE) que va a mediar las interacciones con otras proteínas SNARE. Cuando dos membranas se van a fusionar, el acercamiento entre ellas provoca la interacción, mediante los motivos SNARE, de tres miembros de proteínas SNARE (uno de cada familia descrita) anclados en membranas opuestas (VAMPs en la vesícula donadora y STX y SNAP25 en la membrana aceptora), formando lo que se conoce como complejo SNARE. La formación de este complejo genera la fuerza necesaria para que se produzca la fusión entre membranas y la formación del poro de fusión por donde se liberará el contenido de la vesícula al exterior celular.
Resultados previos han demostrado la implicación de SNAP23 en la secreción de Igs. Teniendo en cuenta esto, nos planteamos la hipótesis de que la proteína SNAP23 debe interaccionar con al menos un miembro de la familia de STXs y con otro de la familia de VAMPs para formar el complejo que lleva a cabo la secreción de Igs en CPs humanas. El objetivo general de este trabajo ha sido, por tanto, identificar los miembros de la familia de STXs y VAMPs implicadas, junto con SNAP23, en dicho proceso.
Como herramienta de trabajo se ha usado la línea celular U266, productora de IgE, procedente de mieloma múltiple. También se han utilizado CPs humanas normales purificadas de amígdala y de lámina propia de colon.
Se ha definido mediante Western blot la expresión de diversos miembros de la familia de STXs (3 y 4) y de VAMPs (2-5, 7 y 8) en CPs humanas. Se ha caracterizado la localización intracelular de dichas proteínas; STX 3 y 4 están preferentemente localizadas en la membrana plasmática, aunque STX3 también se encuentra distribuida en una estructura citoplasmática que colocaliza, en parte, con una proteína del Golgi. Los miembros de la familia VAMP tienen una distribución claramente citoplasmática vesicular. Algunos de ellos, como VAMP3 y VAMP4, colocalizan parcialmente con orgánulos propios de la vía endocítica como son los endosomas tempranos. Otros, como VAMP7, presentan una distribución perinuclear muy definida.
Se realizaron ensayos de colocalización de diferentes miembros de la familia VAMP con un marcador de IgE humana y se observó una colocalización parcial entre VAMP2 y las vesículas que transportan dicha IgE.
En lo referente a interacciones entre los distintos miembros de proteínas SNARE, mediante coinmunoprecipitación y localización ¿in situ¿, se ha detectado que SNAP23 interacciona con STX3, STX4 y VAMP2.
En cuanto a ensayos funcionales se han realizado técnicas de silenciamiento génico con siRNA y con vectores lentivirales (shRNA) y ensayos de pérdida de función, en el caso de VAMP2, degradando la proteína mediante el uso de neurotoxinas. Tras cada ensayo se midió la secreción de IgE en el cultivo mediante ELISA. De este modo se vió que VAMP2 y STX4, pero no STX3, están implicadas en la secreción de Igs en CPs humanas. Estos datos fueron corroborados con los resultados obtenidos tras sobreexpresar en las células STX3, STX4 y VAMP2 y los respectivos dominantes negativos de dichas proteínas.
Teniendo en cuenta que SNAP23 interacciona con STX4 y VAMP2, que la inhibición tanto de STX4 como VAMP2 hace que disminuya la secreción de Igs y que, mediante inmunofluorescencia hemos visto que VAMP2 colocaliza con vesículas que transportan la IgE en CPs, podríamos concluir que el complejo SNARE; SNAP23-STX4-VAMP2 podría ser, al menos uno, de los complejos implicados en la fusión de la membrana de las vesículas que transportan las Igs con la membrana plasmática de la célula para llevar a cabo la secreción de dichas Igs al exterior celular.
