Resumen de Estudio del dominio de unión a DNA de la proteína terminal del bacteriófago [phi]29 y su papel en la replicación del DNA viral
El mecanismo de replicación iniciada con proteína terminal (TP) del bacteriófago ¿29 ha sido extensamente estudiado in vitro. Sin embargo, se conoce muy poco sobre la organización espacial y temporal de la replicación de ¿29 in vivo. En la presente Tesis se ha estudiado la localización subcelular de los principales componentes de la maquinaria replicativa del bacteriófago ¿29, es decir, la TP y la DNA polimerasa viral. Tanto la TP iniciadora como la TP parental localizan en el nucleoide bacteriano en ausencia de otros componentes virales. Por otra parte, la localización de la DNA polimerasa viral tiene lugar a lo largo de toda la longitud celular cuando es expresada de manera individual, pero localiza en el nucleoide bacteriano cuando es coexpresada junto con la TP. Por tanto, la expresión de la TP determina la localización de la DNA polimerasa viral en el nucleoide bacteriano. Durante el proceso infectivo, ambas proteínas colocalizan con el nucleoide bacteriano, siguiendo su dinámica de segregación. En etapas intermedias del ciclo celular tanto la TP como la DNA polimerasa viral exhiben un patrón de localización tipo helicoidal en células infectadas, patrón que depende de la proteína del citoesqueleto tipo actina de Bacillus subtilis MreB. Además, se ha determinado que el dominio N-terminal de la TP es el responsable de su localización en el nucleoide bacteriano, mostrando que la presencia de este dominio es esencial para que se dé una replicación eficiente del DNA viral durante la infección. Trabajos anteriores determinaron que el dominio N-terminal de la TP de ¿29 tiene capacidad de unión a DNA in vitro. En la presente Tesis se han estudiado los residuos aminoacídicos del dominio N-terminal de la TP implicados en su unión a DNA. Asimismo, se ha determinado que la TP de ¿29 se une al DNA genómico de B. subtilis in vivo, encontrándose una correlación entre la capacidad de unión a DNA y la localización en el nucleoide bacteriano. La resolución de la estructura cristalográfica del heterodímero formado por la DNA polimerasa y la TP no permitió determinar la estructura del dominio N-terminal de la TP, al encontrarse desordenado en el cristal. En la presente Tesis se ha analizado la estructura secundaria del dominio N-terminal mediante dicroísmo circular, mostrando que tiene un alto contenido en ¿-hélice. Por otra parte, se ha estudiado el papel que la unión a DNA de la TP puede tener en la replicación del DNA viral in vitro mediante la caracterización bioquímica de TPs mutantes en residuos básicos del dominio N-terminal, encontrándose que los mutantes defectivos en unión a DNA están afectados en diferentes etapas de este proceso. La proteína viral de unión a DNA de doble banda p6 compensa los defectos de iniciación y transición de estas TPs mutantes. Además, se ha determinado que el dominio N-terminal de la TP es necesario para una unión eficiente a la DNA polimerasa, así como para la amplificación del TP-DNA in vitro. En conjunto, estos resultados nos permiten proponer un papel del dominio N-terminal de la TP en el reconocimiento y apertura del origen de replicación.
The protein-priming mechanism of bacteriophage ¿29 DNA replication has been extensively studied in vitro. However, little is known about the spatial and temporal organization of the ¿29 replication process in vivo. In this Thesis the subcellular localization of the main components of the bacteriophage ¿29 replicative machinery has been studied, i.e., the terminal protein (TP) and the viral DNA polymerase. Both the primer and parental TP localize at the bacterial nucleoid in the absence of other viral components. On the other hand, the DNA polymerase localizes along the cellular length when it is expressed individually, but it localizes at the bacterial nucleoid when it is co-expressed together with TP. Therefore, TP expression determines DNA polymerase localization at the bacterial nucleoid. During infection, both proteins colocalize at the bacterial nucleoid following its segregation dynamics. At middle stages of the cell cycle both the TP and the DNA polymerase display a helix-like localization pattern in infected cells, this pattern depending on the Bacillus subtilis actin-like cytoskeleton protein MreB. Furthermore, it has been determined that the TP N-terminal domain is responsible for its nucleoid localization, being the presence of this domain essential for an efficient viral DNA replication during the infective process. Previous works have shown that the TP N-terminal domain possesses DNA binding capacity in vitro. In this Thesis the TP N-terminal domain amino acidic residues involved in DNA binding have been studied. Additionally, it has been determined that ¿29 TP binds B. subtilis genomic DNA in vivo, finding a correlation between DNA binding capacity and nucleoid localization. The resolution of the crystallographic structure of the heterodimer formed by the DNA polymerase and the TP could not solve the structure of the TP N-terminal domain, as it was disordered in the crystal lattice. In the present work the secondary structure of the TP N-terminal domain has been analysed by circular dichroism, showing that it has a high proportion of ¿-helix. Additionally, by means of the biochemical characterisation of mutant TPs in basic residues of the N-terminal domain, the possible role of TP DNA binding capacity in viral DNA replication in vitro has been studied. TP mutants defective in DNA binding are affected in performing different stages of viral DNA replication. The viral double-stranded DNA binding protein p6 overcomes the initiation and transition defects of these mutant TPs. In addition, it has been determined that the TP N-terminal domain is necessary for an efficient binding to the DNA polymerase as well as for TP-DNA amplification in vitro. On the whole, these results allow us to propose a role of the TP N-terminal domain in the recognition and unwinding of the replication origin
