Proteïnes petites i riques en ponts disulfur com a models de producció recombinant i plegament
- Autores: Sílvia Bronsoms i Fabrellas
- Directores de la Tesis: Francesc Xavier Avilés Puigvert (dir. tes.), Josep Villanueva Cardús (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2003
- Idioma: catalán
- ISBN: 84-688-0222-0
- Depósito Legal: B.46.453-2002
- Tribunal Calificador de la Tesis: Enrique Querol Murillo (presid.), Josep Vendrell Roca (secret.), Juan J. Calvete (voc.), Joaquin Abian Moñux (voc.), Antonio Planas Sauter (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TDX
- Resumen
El PCI, la hirudina i el LCI formen part de la família de proteïnes petites i riques en ponts disulfur, que conté un gran nombre de biopèptids amb potencials aplicacions biotecnològiques, com són els factors de creixement, les toxines, els inhibidors de proteases o desintegrines.
A causa de la presència dels ponts disulfur lexpressió recombinant daquestes proteïnes és complexa. En el primer treball de la tesi sestudien tres sistemes de producció recombinant: un sistema eucariota (Pichia pastoris) i dos sistemes procariotes (Escherichia coli). Soptimitzen diversos paràmetres per tal de millorar el seu nivell de producció i es busquen sistemes que permetin simplificar el seu procés de purificació. Saconsegueix desenvolupar un sistema en E.coli amb una producció final de proteïna que és 10 cops superior al sistema de partida.
En el segon treball sanalitza el paper de les regions precursores del PCI en el plegament de la forma madura. Sanalitza el procés de replegament oxidatiu in vitro de les diverses pro-formes del PCI per tal de caracteritzar la seva influència sobre la velocitat o la eficiència del plegament de la forma madura. També sestudia la influència de la pro-regió N-terminal sobre el procés de plegament in vivo en E.coli del PCI madur i duna sèrie de mutants que presenten un mal plegament o un baix nivell dexpressió recombinant. Finalment es duu a terme una caracterització estructural de la forma corresponent al PCI amb la pro-regió N-terminal a través destudis de bescanvi protó/deuteri, exoproteòlisi limitada, espectroscopia de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear.
En lúltim treball sanalitza el procés de plegament proteic de la hirudina i del LCI a través de lestudi de les reaccions de bescanvi protó/deuteri seguides per espectrometria de masses MALDI-TOF. Es caracteritza ladquisició destabilitat conformacional al llarg del procés de plegament de les dues proteïnes. Saïllen una sèrie dintermediaris de plegament i es determina la seva estabilitat; la qual cosa ens permet estudiar les diferències existents entre les vies de plegament de les dues proteïnes. Finalment sestima la contribució de les interaccions covalents i no-covalents en lestabilitat final de la proteïna nativa.
-------------------------------------------------- PCI, hirudin and LCI belong to the familly of small disulfide-rich proteins, which also contains other biologically important biopeptides like growth factors, desintegrins, toxins or protease inhibitors.
These proteins cannot be usually produced at high levels by recombinant DNA approaches due to the presence of the disulfide bridges. To deal with this, we selected three different systems for heterologous expression: one based in external secretion by the yeast Pichia pastoris and two others based in the periplasmic secretion in Escherichia coli, using powerful promoters in all cases. Several parameters were optimized to improve PCI production and to simplify the purification protocol. Finally, a new method was developed, which lead to a final PCI production 10-fold higher than the previously described system.
In the second work of the thesis, the role of the PCI pro-regions on the mature peptide folding was analyzed. The in vitro oxidative refolding of mature PCI was compared with that of the pro-forms to characterize their influence on mature PCI folding rates and folding efficiency, using RP-HPLC to analyze the acid-trapped disulfide intermediates collected during the refolding process. The influence of the N-terminal pro-region on the expression or folding of several PCI variants reported to give a low expression yield or a low folding efficiency in vivo in E.coli was also studied. In addition, the presence of ordered structural elements in the N-terminal extension of PCI was investigated by deuteron to proton exchange, limited exoproteolysis, circular dicroism spectroscopy and nuclear magnetic ressonance.
In the last work, the folding process of hirudin and LCI was analyzed by deuteron to proton exchange monitored by MALDI-TOF mass spectrometry. The comparison of the number of slow exchanging protons of different samples along the folding pathway provided an easy and fast way to follow the protein folding process. Additionally, the deuteron to proton exchange experiments on purified folding intermediates allowed us to characterize the differences between the two folding pathways and to measure the contribution of the disulfide bonds versus the non-covalent forces to the stability of the native protein.
