Resumen de Three dimensional organization mechanisms and polarized protein traffic in thyroid follicular cells
The structural and functional unit of the thyroid gland is the thyroid follicle that consists in a single layer of follicular cells enclosing a central lumen where thyroid hormones are synthesized and stored. Follicular cells or thyrocytes are epithelial polarized cells with the apical membrane facing the lumen and the basal membrane surrounded by the basement membrane towards the stroma. We have studied the follicle formation process in three dimensional (3D) Matrigel cultures using the rat follicular cell line FRT and mouse primary thyrocytes. Our results demonstrate that follicles originated either from single or plural cells acquire apical¿basal polarity after the first cell division. Apical membrane is defined at a specific site of the cell¿cell junctions where the exocytosis of apical membrane components occurs. Lumen is formed by further apical exocytosis followed by membrane separation or coalescence between apical vacuolar compartments. Mature tight junctions separate the apical from the basolateral domains and both actin filaments and acetylated microtubules exhibit a polarized apical distribution. Through microarray¿based differential expression analysis we have identified regulators of 3D follicular organization. Among them, Pax8 transcription factor was discovered to play a critical role in polarity orientation and follicle formation. In the absence of Pax8 apical membrane orientation was inverted and lumen formation was impaired. The polarized distribution of cell cytoskeleton was altered due to the transcriptional inhibition of both cadherin¿16 and its cytoskeleton linker, ¿B¿crystallin. Apical transport of Rac1 through actin filaments was also blocked and thus local actin organization and apical traffic were affected. Other Pax8 transcriptional targets described to be involved in apical transport such as Rab17 and myosin Vb could also participate in follicular apical membrane formation. Thyroid function is determined by the polarized distribution of thyroid specific proteins at the apical¿basal membranes and inside the lumen. NIS, the sodium/iodide symporter, is a key protein for iodide uptake and thyroid hormone synthesis, and is localized in the basolateral plasma membrane. We have identified a clathrinmediated pathway responsible for NIS basolateral traffic, in which the clathrin adaptor complexes AP¿1A and AP¿1B sort NIS at the trans¿Golgi and the recycling endosomes. More specifically, we have demonstrated that the medium subunit of AP¿1B controls NIS basolateral sorting through common recycling endosomes. In its absence, NIS is apically missorted where remains functional. Besides, direct NIS basolateral transport from the trans¿Golgi to the basolateral membrane is mediated by AP¿1A through clathrin¿coated vesicles that also carry the transferrin receptor. In the absence of AP¿1A medium subunit, AP¿1B fully compensates its function. NIS internalization pathways were also studied and preliminary results have shown that the mechanism is clathrin¿independent and that NIS is finally degraded by lysosomes.
La unidad estructural y funcional del tiroides es el folículo tiroideo que consiste en una capa de células foliculares posicionadas alrededor de un lumen central donde se sintetizan y se almacenan las hormonas tiroideas. Las células foliculares o tirocitos son células epiteliales polarizadas con la membrana apical hacia el lumen y la membrana basal rodeada de la lámina basal hacia el estroma. Hemos estudiado la formación del folículo en cultivos tridimensionales (3D) de Matrigel usando la línea tiroidea de rata FRT y cultivos primarios de tirocitos de ratón. Nuestros resultados demuestran que los folículos formados tanto a partir de una como de varias células, adquieren la polaridad ápico¿basal tras la primera división. La formación de la membrana apical se inicia entre las uniones célula¿célula en el sitio donde se exocitan los componentes de la membrana apical. El lumen se forma tras la exocitosis seguida por la separación de las membranas apicales o por coalescencia entre compartimentos apicales de vacuolas. Las uniones estrechas separan el dominio apical del dominio basolateral, y los filamentos de actina junto con los microtubulos acetilados se distribuyen apicalmente. Mediante un array de expresión hemos identificado reguladores de la organización folicular en 3D. De entre ellos el factor de transcripción Pax8 resultó tener un papel esencial en la orientación de la polaridad y en la formación del folículo. En ausencia de Pax8 la orientación de la membrana apical se invierte y se impide la formación del lumen. La distribución polarizada del citoesqueleto se altera debido a la inhibición transcripcional tanto de la cadherina¿16 como de su proteína de unión al citosqueleto, la cristalina alfa B. El transporte apical de Rac1, a través de los filamentos de actina, se inhibe y como consecuencia la organización apical de actina y el tráfico están afectados. Otras dianas transcripcionales de Pax8 que están involucradas en el transporte apical, como las proteínas Rab17 y myosina Vb, podrían estar también participando en la formación de la membrana apical. La función tiroidea depende de la localización polarizada de proteínas específicas de tiroides en la membrana ápico¿basolateral y dentro del lumen folicular. El simportador de sodio/yoduro, localizado en la membrana basolateral es una proteína clave para la captación del yoduro y la síntesis de las hormonas tiroideas. Hemos identificado una vía mediada por clatrina como responsable del tráfico basolateral de NIS, en la cual los complejos adaptadores de clatrina AP¿1A y AP¿1B segregan a NIS a nivel del trans¿Golgi y de los endosomas de reciclaje. Hemos demostrado que la subunidad mediana de AP¿1B controla el tráfico basolateral de NIS a través de los endosomas comunes de reciclaje. En su ausencia, NIS se transporta a la membrana apical donde sigue siendo funcional. AP¿1A participa en el tráfico directo de NIS del trans¿Golgi a la membrana basolateral a través de vesículas cubiertas de clatrina que cotransportan el receptor de transferrina. En ausencia de su subunidad mediana, AP¿1B compensa su función. También estudiamos las vías de internalización de NIS y resultados preliminares muestran que el mecanismo es independiente de clatrina y que NIS es finalmente degradado en los lisosomas.
