Structural and metabolic aspects of multicellularity in a heterocyst-forming cyanobacterium

• Autores: Mireia Burnat Clemente
• Directores de la Tesis: Enrique Flores García (dir. tes.), Antonia Herrero Moreno (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2015
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 180
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Javier Cejudo Fernández (presid.), Isabel Esteve Martínez (secret.), Bruce Arthur Osborno (voc.), Belén Floriano Pardal (voc.), Conrad W. Mullineaux (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Microbiología
      • Fisiología bacteriana
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen
  • español

    La multicelularidad ha surgido numerosas veces a lo largo de la evolución, habiendo aparecido en diferentes grupos filogenéticos, incluidas las cianobacterias, un grupo de procariotas que realizan la fotosíntesis oxigénica y exhiben un amplio rango de procesos de desarrollo. Las cianobacterias representan uno de los grupos más diversos del mundo bacteriano, incluyendo organismos con distintas morfologías, desde estirpes unicelulares hasta otras que forman filamentos multicelulares. Algunas cianobacterias filamentosas pueden presentar células especializadas en distintas funciones fisiológicas. En algunos casos, esta diferenciación celular permite que el filamento cianobacteriano lleve a cabo simultáneamente procesos que son funcionalmente incompatibles, como la fotosíntesis oxigénica y la fijación del nitrógeno atmosférico. El objetivo general de esta tesis ha sido el estudio de algunos aspectos estructurales y metabólicos de la multicelularidad en la cianobacteria formadora de heterocistos modelo Anabaena sp. PCC 7120. Las cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos crecen formando cadenas de células (filamentos o tricomas), y presentan proteínas septales, como SepJ, que son elementos importantes para la adhesión celular y la filamentación (el proceso de formación y mantenimiento de los filamentos). Desde un punto de vista estructural, las cianobacterias son organismos didérmicos, presentando dos membranas celulares: la membrana citoplasmática y la membrana externa, esta última rodeando externamente a la capa de peptidoglicano (o saco de mureina). En el caso de las cianobacterias filamentosas, la membrana externa es continua a lo largo del filamento, determinando así un espacio periplásmico continuo que contiene la capa de peptidoglicano. A pesar de que la envuelta celular de las cianobacterias se ha estudiado en detalle recientemente, el papel de esta estructura en la multicelularidad no se había planteado previamente. El Capítulo 1 de esta tesis aborda el posible papel de los componentes de la envuelta celular en la filamentación. Para ello, se ha estudiado la longitud de los filamentos y la respuesta a la fragmentación mecánica de una colección de mutantes de genes relacionados con la formación del peptidoglicano y de la membrana externa, incluyendo dos estirpes con mutaciones en genes que determinan penicillin-binding proteins (proteínas de unión a la penicilina) de clase B generados en este trabajo. Los resultados obtenidos indican que la alteración tanto de los componentes de la capa de peptidoglicano como de la membrana externa afectan a la filamentación, contribuyendo así al crecimiento de Anabaena formando largos tricomas, aunque ninguno de estos elementos de la envuelta celular es tan relevante para la filamentación como la proteína septal SepJ. Los procesos de la fotosíntesis y la fijación del N2 están compartimentados en el filamento diazotrófico, lo que conlleva un intercambio de nutrientes entre las células vegetativas y los heterocistos. Las células vegetativas exportan a los heterocistos productos derivados de la fijación del CO2, como la sacarosa, el glutamato y la alanina, y a su vez los heterocistos aportan a las células vegetativas productos de la fijación del N2 atmosférico. Previamente se había identificado la glutamina como un vehículo de nitrógeno, pero se consideraba que podía haber otros metabolitos nitrogenados adicionales que se transfiriesen de los heterocistos a las células vegetativas. El Capítulo 2 de esta tesis aborda el papel de la cianoficina, un polímero de aspartato y arginina que funciona como reservorio dinámico de nitrógeno, en la fisiología cianobacteriana, y de sus productos derivados como posibles vehículos nitrogenados en el filamento diazotrófico. Los resultados confirman que en Anabaena la ORF all3922 es el gen que determina la isoaspartil dipeptidasa, enzima implicada en el segundo paso de la degradación de cianoficina. En condiciones diazotróficas, la enzima se expresa en las células vegetativas, lo cual implica que el dipéptido ß-aspartilarginina producido por la cianoficinasa en los heterocistos se transfiere intercelularmente a las células vegetativas, donde se hidroliza liberando aspartato y arginina. De este modo, se ha identificado el dipéptido ß-aspartil-arginina como vehículo nitrogenado en el filamento diazotrófico. La arginina es un metabolito importante en la fisiología de las cianobacterias, no sólo porque es un constituyente de la cianoficina sino también porque puede servir como vehículo intercelular de nitrógeno, al menos como parte del dipéptido ß-aspartil-arginina. Sin embargo, el catabolismo de la arginina en las cianobacterias no se conoce en detalle, y sólo se han publicado unos pocos estudios acerca de las enzimas relacionadas con el mismo. En el Capítulo 3 y el Anexo II de esta tesis se han caracterizado dos genes, alr2310, que determina una proteína de la familia de las ureohidrolasas, y alr4995, que determina una proteína perteneciente a la familia de enzimas modificadoras del grupo guanidino, investigándose sus posibles funciones en el catabolismo de la arginina. Los resultados muestran que alr2310 es el gen speB de Anabaena, que determina una agmatinasa cuya inactivación causa un efecto tóxico severo que puede ser consecuencia de una interferencia de la agmatina acumulada en el mutante con la diferenciación de los heterocistos. Se encontró asimismo que la agmatinasa se acumula preferentemente en las células vegetativas durante el crecimiento diazotrófico. Por otra parte, Alr4995 es una nueva enzima que genera prolina a partir de arginina en dos pasos, siendo la ornitina (o la citrulina) un metabolito intermediario de dicha reacción. Los resultados de este trabajo indican que la envuelta celular es esencial para la filamentación en las cianobacterias formadoras de heterocistos, y que éstas presentan características únicas y altamente coordinadas de compartimentación celular de vías metabólicas como estrategia de organización multicelular.

  • English

    Multicellularity appears to have arisen several times during the course of evolution and has evolved in different phylogenetic groups, including cyanobacteria, a highly diverse group of oxygenic photosynthetic prokaryotes that exhibit a wide range of developmental processes. Cyanobacteria represent one of the most diverse prokaryotic phyla, with morphotypes ranging from unicellular to multicellular filamentous forms. Some filamentous cyanobacteria can produce different types of cells, each one with specific functions. In some cases, cell differentiation allows the filament to carry out tasks that are functionally incompatible, such as oxygenic photosynthesis and the fixation of atmospheric nitrogen. The general plan in this thesis was to address the study of some structural and metabolic aspects of multicellularity in the model heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Heterocyst-forming cyanobacteria grow as chains of cells (trichomes or filaments), and septal proteins, such as SepJ, are important for cell-cell contact and filament formation. From a structural point of view, cyanobacteria are diderm bacteria, bearing two cellular membranes: the cytoplasmatic membrane and an outer membrane, the latter residing outside of the peptidoglycan layer (or murein sacculus). Filamentous cyanobacteria present a continuous outer membrane along the filament, determining the presence of a continuous periplasmic space that contains the peptidoglycan layer. Although the cell envelope from cyanobacteria has been studied in some detail, the role of this structure in multicellularity has not been addressed until recently. Chapter 1 of this thesis focuses on the possible role of cell envelope components in filamentation, the process of producing and maintaining filaments, thus contributing to the growth of Anabaena forming long trichomes. In order to address this structural aspect of multicellularity in Anabaena sp. PCC 7120, a set of available peptidoglycan- and outer membrane-related gene mutants and strains with mutations in two genes encoding class B penicillin-binding proteins isolated in this work have been used to study filament length and the response of their filaments to mechanical fragmentation. The results obtained indicate that alteration of both the peptidoglycan layer and the outer membrane influence filamentation, although none of these elements is as important as the septal protein SepJ. Because of the compartmentalization of photosynthetic CO2 fixation and N2 fixation processes in different cell types, an intercellular exchange of nutrients takes place in the cyanobacterial filament. Vegetative cells donate products of CO2 fixation, such as sucrose, glutamate and alanine to the heterocysts. Heterocysts, in turn, provide N2 fixation products to the vegetative cells, being glutamine a previously identified metabolite. However, the nitrogenous metabolites that are transferred from heterocysts to vegetative cells are still not fully known. The work presented in Chapter 2 aimed to study the role of cyanophycin, a biopolymer that serves as a dynamic nitrogen cellular reserve material, in the diazotrophic physiology, and of its derivative products as possible nitrogen vehicles in the diazotrophic filament of Anabaena. The results confirmed that ORF all3922 of Anabaena sp. PCC 7120 is the gene encoding isoaspartyl dipeptidase, the enzyme involved in the second step of cyanophycin degradation. Under diazotrophic conditions, the enzyme accumulates in vegetative cells, implying that the ß-aspartyl-arginine dipeptide produced by cyanophycinase in heterocysts is transferred intercellularly to the vegetative cells, where it would be hydrolysed releasing aspartate and arginine. Thus, the ß-aspartyl-arginine dipeptide has been identified as a nitrogen vehicle in the diazotrophic filament. Arginine appears to be an important metabolite in the physiology of cyanobacteria, not only because it is found in cyanophycin, but also because it might function as a nitrogen vehicle for intercellular molecular exchange, at least in part as ß-aspartyl-arginine. However, arginine catabolism is not well understood in these microorganisms and only few studies have been published regarding arginine catabolic enzymes. In Chapter 3 and Annex II of this thesis, the study of two genes, alr2310, encoding an ureohydrolase family protein, and alr4995, encoding a protein belonging to the guanidine-group modifying enzymes superfamily, has been addressed in order to investigate their possible roles in arginine catabolism. The results showed that Alr2310 is the speB gene of Anabaena sp. PCC 7120, encoding an agmatinase, which accumulates preferentially in vegetative cells during diazotrophic growth, and that its inactivation leads to a severe toxic effect that could result from interference of accumulated agmatine with heterocyst differentiation. On the other hand, Alr4995 is a novel enzyme that generates proline from arginine in a two-step reaction, with ornithine (or citrulline) as intermediate metabolite. The concluding remarks of this work is that the heterocyst-forming cyanobacteria present highly coordinated and unique features of compartmentalized metabolic pathways as a strategy of multicellular behavior.