El factor PIF4 es un integrador de las señales de brasinosteroides (BR) y giberelinas (GA)

• Autores: Stella Bernardo García
• Directores de la Tesis: Salomé Prat (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2014
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Isabel Mª Díaz Lozano (presid.), Marta Martín Basanta (secret.), Michael Sauer (voc.), Elena Monte Collado (voc.), David Alabadí Diego (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • El crecimiento de las plantas está regulado por las condiciones ambientales, y principalmente por cambios en las condiciones de luz y temperatura. La luz afecta a casi todas las etapas del desarrollo de la planta, además, aporta información clave relativa a su entorno más cercano. La acción coordinada de la luz, la temperatura, el reloj interno y las hormonas giberelinas (GA) y brasinosteroides (BR) modula el tamaño final de sus diferentes órganos y determina diferentes procesos de desarrollo, al controlar la expresión de un gran número de genes implicados en la expansión de la pared celular y en la señalización por auxinas. Los factores PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR (PIFs) han mostrado ejercer un papel central en la elongación del hipocotilo y actuar como integradores de todas estas señales. Estos factores unen elementos G-box y E-box en los promotores de genes implicados en la remodelación de la pared celular y en la síntesis y señalización de auxinas, activando su transcripción (Castillon et al., 2007). La luz regula la estabilidad de los PIFs, al inducir su interacción con la forma fotoactiva de PHYB, que promueve su fosforilación y degradación por el sistema proteasoma (Castillon et al., 2007). La ruta de señalización de GA ejerce un papel clave en la función de estos factores, ya que se ha demostrado que los represores DELLA se unen a su dominio bHLH y bloquean su unión al ADN (de Lucas et al., 2008). Recientemente se ha establecido que los PIFs están co-activados por los factores BES1 y BZR1, lo que destaca un papel adicional de estos factores en la integración de la señal de BRs (Oh et al., 2012). Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en la interacción de las rutas de señalización de GAs y BRs, no han sido aún resueltos en su totalidad. La aplicación de BL recupera el fenotipo enano de los mutantes deficientes o insensibles a GAs, además, es necesaria una ruta activa de señalización de BRs para una respuesta correcta a la aplicación de GAs. Curiosamente, los BRs no afectan la estabilidad de las proteínas DELLA, ya que en mutantes deficientes en BRs, estos represores se degradan tras la aplicación de GAs igual que en las plantas silvestres. Sin embargo, estos mutantes muestran un fenotipo enano después de la aplicación de GAs, lo que indicaría que las rutas de señalización de GAs y BRs convergen por debajo de las DELLAs. En este trabajo, mostramos que el enzima GSK3 quinasa BIN2, al fosforilar los factores BES1 y BZR1, promoviendo su exclusión del núcleo y degradación, es también capaz de interaccionar con PIF4. Demostramos que PIF4 es una diana de fosforilación de BIN2, y que esta modificación marca a la proteína PIF4 para su degradación por el proteasoma. Generamos una variante de este factor, la proteína PIF1A, en la cual eliminamos uno de los motivos consenso de fosforilación de BIN2. Mostramos que la eliminación de este dominio provoca una fuerte estabilización de la proteína PIF4, y que la expresión de PIF41A causa un fenotipo caracterizado por una floración extremadamente temprana y crecimiento muy alargado, debido a la sobre-activación de sus genes diana. Sin embargo, la proteína PIF41A no es capaz de recuperar el fenotipo enano de plantas mutantes bin2-1, debido a una activación constitutiva de la quinasa BIN2. Dado que se ha establecido que los factores BES1 y BZR1 actúan como co-activadores de los factores PIFs, es posible que la mutación PIF41A no sea capaz de recuperar el fenotipo mutante bin2-1 debido a que esta quinasa sigue fosforilando a los factores BES1 y BZR1. Los mutantes bes1-D y bzr1-1D muestran una respuesta constitutiva a BRs. Se ha visto que los factores PIFs son necesarios para la respuesta constitutiva a BRs de estos mutantes (Oh et al., 2012), lo que indicaría que la acción concertada de estas dos familias de reguladores transcripcionales es esencial para promover elongación celular. En este estudio demostramos que los mutantes bes1-D muestran aún una inhibición en el crecimiento del hipocotilo en presencia del inhibidor BRZ en luz, y que la expresión conjunta de PIF41A y bes1-D conduce a una respuesta totalmente insensible a BRZ y la activación de los genes diana, incluso en presencia de este inhibidor. Estas plantas se caracterizan además por presentar un crecimiento continuado tanto en el día como en la noche, al contrario que las plantas silvestres en las cuales el hipocotilo crece sólo al final de la noche. En estudios en los que se comparó la estabilidad de las proteínas PIF4 y PIF41A, observamos que PIF41A se estabiliza preferentemente al amanecer, coincidiendo con el máximo crecimiento del hipocotilo, y que si bien la aplicación de BL o BRZ modifican la estabilidad de la proteína silvestre PIF4, PIF41A muestra niveles similares de acumulación en ambos tratamientos. En conjunto, estos resultados revelan un nuevo mecanismo de acción de los BRs, por el cual estas hormonas actúan de forma antagónica a la señalización por luz, inhibiendo la desestabilización del factor PIF4 mediada por la quinasa BIN2. Esta regulación sería especialmente relevante en el control de la elongación del hipocotilo al final de la noche, antes de la luz active a PHYB y la acumulación de las DELLAs limite la actividad transcripcional de PIF4.

    Plant growth is regulated by environmental conditions, mostly by changes in light and temperature. Light affects almost every aspect of plant development and physiology, as it provides the energy required for photo-assimilation, in addition to serve as an informational cue of the environment in which the plant grows. Coordinated action of light, temperature, the endogenous clock and the hormones gibberellins (GA) and brassinosteroids (BR) control the size of the various plant organs and trigger different developmental processes, by affecting the expression of genes involved in cell wall loosening and auxin regulation. The PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs (PIFs) showed to play a central role in hypocotyl elongation, by integrating all of these signals. These transcription factors bind G-box and E-box elements in the promoters of diverse cell wall-remodelling and auxin synthesis and signalling genes, to activate their transcription (Castillon et al., 2007). Light regulates PIFs activity, by inducing their interaction with photoactivated PHYB, which triggers phosphorylation of these factors and marks them for proteasomal degradation (Castillon et al., 2007). GA signalling plays an important role in the PIFs regulation, as DELLA repressors were found to bind the bHLH domain of these factors and block their DNA recognition ability (de Lucas et al., 2008). More recent findings established that PIFs are co-activated by the BES1 and BZR1 factors, with a central role in BRs signalling, highlighting an additional role of these regulators in BR signal integration. PIFs act in a concerted manner with BES1/BZR1 factors to activate the expression of different genes regulated by BR (Oh et al., 2012). However, the molecular mechanisms involved in cross-talk regulation of the GA and BRs pathways remain to be fully solved. The application of BL rescues the dwarf phenotype of GA-deficient and insensitive mutants and an active BR pathway is essential for GA-promotion of hypocotyl growth. Interestingly, BRs do not affect stability of the DELLA proteins, as these repressors were shown to be equally destabilized by GAs in BR-deficient mutants as in the wild-type. However, these mutants still exhibit a dwarf phenotype after GA application, suggesting that cross-talk between these hormones occurs downstream of the DELLAs. In this work, we show that PIF4 binds the GSK3 kinase BIN2. We demonstrate that PIF4 is phosphorylated by BIN2. We generated a mutant of this factor, the PIF41A protein, in which we eliminated one of the phosphorylation consensus of BIN2. We show that mutation of this domain leads to strong stabilization of the protein and that expression of PIF41A causes an extremely early and severe elongated phenotype, due to up-regulated levels of expression of its gene targets. However, this protein showed to be unable to suppress the dwarf phenotype of bin2-1 mutant seedlings, with a constitutive activation of the kinase BIN2. Given that the BES1 and BZR1 factors were established to act as co-activators of PIFs (Oh et al., 2012), it was plausible that PIF41A does not suppress the dwarf phenotype of bin2-1 mutants. The bes1-D and bzr1-1D mutants display a constitutive response to BRs. We show that the bes1-D mutants are not insensitive to the inhibitor BRZ in the light, but display a reduction in hypocotyl growth, and that expression of PIF41A and bes1-D leads to a fully insensitive response to BRZ and up-regulated expression of their gene targets in the presence of this inhibitor. These plants are in addition characterized by showing a continuous growth during day and night; in opposite to the wild-type that shows maximal growth at dawn (Nozue et al., 2007). In studies where we compared stability of the PIF4 and PIF41A proteins, we observed that PIF41A is preferentially stabilized at dawn, coinciding with the interval of maximal hypocotyl growth, and that application of BL or BRZ modified the stability of the wild-type PIF4 protein, but did not affect PIF41A protein levels. Altogether, these results reveal a novel mechanism of action of BRs in antagonizing light signalling, by inhibiting BIN2-mediated destabilization of PIF4 factor. This regulation seems to play a prevalent role in timing hypocotyl elongation to late night, before light activation of PHYB and accumulation of DELLAs restrict PIF4 transcriptional activity