Resumen de Reparación postreplicativa de cortes de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae
Entendemos como corte de doble cadena (doublé-strand break, DSB) toda interrupción en la continuidad de una molécula de ADN que afecte simultáneamente a las dos cadenas que la componen. A pesar de que DSBs programados son necesarios para ciertos procesos celulares, tales como la meiosis (Keeney, 2001), la generación de variabilidad en inmunoglobulinas (Lieber et al., 2004) y el cambio de sexo en levaduras (Haber, 1998b), en general los DSBs constituyen una grave lesión en el ADN. Por lo tanto deben ser reparados correctamente para asegurar la supervivencia de la célula (Resnick and Martin, 1976) y evitar a inestabilidad genética (Chen and Kolodner, 1999; Richardson and Jasin, 2000), un fenómeno que está asociado con la mayoría de los procesos tumorales y algunas enfermedades genéticas (Lengauer et al., 1998). Por consiguiente, el estudio de la reparación de DSBs es fundamental para entender los elementos que aseguran el mantenimiento de la estabilidad del genoma. En células eucariotas existen dos mecanismos fundamentales de reparación de DSBs, la unión de extremos no homólogos (non-homologous end-joining, NHEJ9 y la recombinaciónm homóloga (RH). NHEJ consiste simplemente en la ligación de los extremos de un DSB. En cambio, RH repara un DSB usando como molde una secuencia de ADN homóloga, dando como resultado una transferencia de información genética hacia la molécula que ha sufrido el DSB (conversión genética, CG), que puede estar o no asociado a un intercambio recíproco (cross-over, CO) entre las dos moléculas de ADN. Por lo tanto, el producto de RH depende en gran parte de la naturaleza de la molécula donadora, que puede ser la cromátida hermana (sister-chromatid recombination, SCR), el cromosoma homólogo (recombinación alélica) o secuencias homólogas localizadas en otra parte del genoma (recombinación ectópica).
Nos planteamos como objetivo central de esta Tesis Doctoral el estudio de la SCR como principal mecanismo de reparación postrplicativa. Para ello desarrollamos los siguientes objetivos concretos.
1. Obtener un sistema que nos permita tanto inducir DSBs específicamente durante replicación, como estudiar su posterior reparación por SCR. Decidimos caracterizar en detalle el sistema pRS316-TINV, previamente desarrollado en este laboratorio, que permite la inducción y el análisis molecular de SCE (González-Barrera et al., 2003):
A. En cuanto a la formación de DSBs.
B. En cuanto a los mecanismos de reparación.
2. Determinar la contribución de RH y NHEJ a la reparación de DSBs replicativos.
3. Determinar los requerimientos genéticos de la reparación de DSBs replicativos, tanto por SCE como por otros posibles mecanismos de RH.
4. Analizar el papel del complejo MRX en SCR. Nos planteamos determinar si MRX actúa específicamente en SCR, lo que estaría de acuerdo con un papel estructural del complejo uniendo la molécula rota a su cromátida hermana; o por el contrario desempeña una función general en RH. Para eso decidimos:
A. Analizar SCE en comparación con otros mecanismos de RH en mutantes nulos de MRX.
B. Analizar el papel de la actividad nucleasa de MRX en SCE, así como su relación con Exo1.
5. Determinar otras funciones que actúen específicamente en SCR. Para esto analizamos el papel en SCE, en comparación con otros mecanismos de RH, de:
A. Cohesinas.
B. Complejo Smc5-Smc6.
Por últimos decidimos analizar otro aspecto intrigante de la RH, como es el hecho de que ocurra recombinación en fondo rad51?, y por lo tanto en ausencia de intercambio de cadena. Para esto caracterizamos nivel genético y bioquímico un mutante puntual rad52-L89F, que se había aislado previamente en nuestro laboratorio como afectado específicamente en RH independiente de Rad51.
