MAL regula la secreción de exosomas en células T

• Autores: Leandro Nicolás Ventimiglia
• Directores de la Tesis: Miguel Angel Alonso Lebrero (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2014
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Sánchez Madrid (presid.), María Yañez Mo (secret.), María Mittelbrunn Herrero (voc.), Alicia Llorente Martínez (voc.), Manuel Izquierdo Pastor (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología humana
      • Genética humana
    • Biología vegetal (botánica)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • La capacidad de los organismos multicelulares para coordinar la actividad de cada una de sus células depende del establecimiento de mecanismos de comunicación intercelular apropiados. Además de las comunicaciones intercelulares mediadas por contactos directos entre dos o más células como en el caso de conexiones sinápticas, nanotubos o gap junctions, o por la liberación de moléculas solubles como citoquinas y neurotransmisores, células distantes pueden intercambiar información mediante la secreción y transferencia de distintos tipos de EV capaces de servir como medio de transporte para moléculas bioactivas como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los exosomas son un tipo particular de EV que se caracteriza por tener un origen endosomal como las ILV en los MVE . Nuestro trabajo demuestra que la expresión de la proteína MAL es necesaria para la secreción constitutiva de exosomas en células T Jurkat, ya que además de ser secretada en la fracción exosomal, su silenciamiento tiene como consecuencia una importante disminución en la liberación hacia el medio extracelular de proteínas exosomales como CD 63, CD 81, CD 59 y Rab11. Combinando el análisis mediante microscopía in vitro e in vivo con el estudio por FACS pudimos observar que el silenciamiento de MAL altera notablemente la distribución y el tráfico intracelular de la tetraspanina CD 63. Vimos que MAL y CD 63 colocalizan en endosomas de apariencia multivesicular que se fusionan con la membrana plasmática y descargan su contenido hacia el espacio extracelular. Por otro lado, el silenciamiento de MAL interfiere con el sorting intraluminal de CD 63 en endosomas Rab5-Q79L+ e induce su acumulación sobre la membrana de compartimentos endosomales aberrantes que presentan poco movimiento y aparentemente son incapaces de fusionarse con la membrana plasmática. Nuestros datos indican que MAL no solo es necesaria para la secreción constitutiva de exosomas, sino que también lo es para la secreción inducida por la expresión de la proteína Nef del HIV -1. Hemos observado que Nef induce una alteración en la distribución subcelular y el tráfico de MAL , favoreciendo la acumulación de esta proteína en EE y MVE y promoviendo la aparición de compartimentos endosomales de gran tamaño que podrían corresponder a MVE , en los cuales Nef y MAL colocalizan y son transportadas conjuntamente. Por lo tanto, sugerimos que Nef podría estimular y explotar la ruta de transporte endosomal dependiente de MAL a fin de promover la secreción de exosomas. Por último, teniendo en cuenta la aparente similitud entre los mecanismos que regulan la biogénesis de exosomas y viriones de HIV -1, analizamos el posible papel de MAL durante el ciclo infectivo de este virus. Nuestros datos indican que las células Jurkat MAL KD infectadas con HIV -1 secretan una mayor cantidad de Gag p24 hacia el medio extracelular en comparación con las células Wt. Por otro lado, observamos que la capacidad infecciosa de las partículas virales derivadas de células MAL KD es la misma que la de los viriones derivados de células que expresan MAL ; sin embargo, el silenciamiento de MAL disminuye la transferencia del HIV -1 a través de contactos célula-célula. En conclusión, nuestros resultados indican que la expresión de MAL resulta fundamental para la secreción de exosomas en células T, ya sea ésta constitutiva o inducida por la proteína Nef del HIV -1. Además, sugerimos que la función de MAL podría estar relacionada con la maduración de MVE o con la fusión de estos con la membrana plasmática. Por lo tanto, proponemos que MAL es un factor clave para la secreción de exosomas y que su expresión en células T podría ser determinante para el correcto establecimiento de comunicaciones intercelulares mediadas por esta clase de EV.

    Coordination of single cell activities in multicellular organisms relies on cell¿s ability to communicate with each other. Other than intercellular communications mediated by direct cell-to-cell contacts, such as synaptic connections, nanotubes or gap-junctions, or by diffusion of soluble molecules like cytokines and neurotransmitters, cells are able to exchange information through the secretion and transfer of several kinds of extracellular vesicles carrying bioactive molecules (e.g. lipids, proteins or nucleic acids). Exosomes are a particular type of extracellular vesicles characterized by their endosomal biogenesis as intraluminal vesicles formed inside multivesicular endosomes (MVE ). This work shows that MAL protein expression is essential for the constitutive secretion of exosomes by Jurkat T cells. MAL is secreted in exosomes and its silencing notably reduces the extracellular release of the exosomal proteins CD 63, CD 81, CD 59 and Rab11. Using a combination of confocal microscopy, time-lapse imaging and flow cytometric analysis we observed that MAL silencing notably alters CD 63 trafficking as well as its intracellular localization. Furthermore, MAL and CD 63 colocalize in multivesicular structures that ultimately fuse with the plasma membrane and release their content into the extracellular space. MAL silencing interferes with the intraluminal sorting of CD 63 in Rab5-Q79L+ endosomes and promotes CD 63 accumulation in aberrant endosomes that exhibit poor displacement and are unable to fuse to the plasma membrane. We also found that MAL is not only necessary for the constitutive secretion of exosomes, but also for human immunodeficiency virus type 1 (HIV -1) Nef-induced massive secretion of these vesicles. Nef expression modifies MAL trafficking and subcellular distribution, causing the accumulation of MAL in early endosomes and MVE and promoting the development of large endosomal compartments, presumably MVE , carrying both MAL and Nef. We suggest that Nef boosts the MAL -dependent exosomal route to enhance exosome secretion. Since the processes of biogenesis of exosomes and HIV -1 particles share some specific features, we have also studied the role of MAL during HIV -1 infection. HIV -1 infected Jurkat cells knocked down for MAL expression released higher amounts of Gag p24 protein to the extracellular space than wild type cells. Moreover, the infectivity of viral particles derived from MAL knockdown cells is similar to those produced by MAL -expressing cells. However, when MAL expression is silenced, the transfer of HIV -1 particles through cell-cell contacts was significantly lower. In conclusion, our results indicate that MAL expression is necessary for constitutive and Nef-induced exosomal secretion in T cells. In addition, we suggest that MAL could be involved in the maturation of MVE , or in the fusion of MVE with the plasma membrane. We propose that MAL is a key player in exosomal secretion and suggest that its expression might be essential for the proper establishment of intercellular communication mediated by this kind of extracellular vesicles.