The role of Gbp2p, Nab2p and Pub1p along the mRNA cycle: structural and molecular recognition studies by NMRR and other biophysical techniques
- Autores: Santiago Martínez-Lumbreras
- Directores de la Tesis: José Manuel Pérez Cañadillas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2014
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Marta Bruix Bayes (presid.), Mauricio García Mateu (secret.), Silvia Zorrilla López (voc.), Francisco José Blanco Gutiérrez (voc.), Bertrand Seraphin (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
En esta tesis se realiza un amplio estudio biofísico de tres proteínas de unión a ARN de Saccharomyces cerevisiae (Gbp2p/Hrb1p, Nab2p y Pub1p) centrándose en su estructura e interacciones con otras biomoléculas. Los resultados se discuten en términos de la función (posible función) de estas proteínas en el ciclo celular del ARN mensajero. Los tres estudios siguen un esquema similar basado en un primer análisis estructural de los elementos de reconocimiento de ARN, seguido de la caracterización de la interacción con ácidos nucleicos y finalizando con un estudio más complejo de la intrincada red de interacciones proteína-proteína en la que participan.
En el primer capítulo, se estudian Gbp2p y Hrb1p, dos proteínas parálogas relacionadas con la transcripción pero cuya función específica es desconocida. Se realiza una extensa caracterización químico-física de diversas construcciones de ambas proteínas observándose diferencias de estabilidad que permiten identificar dos unidades estructurales: el tándem formado por los dominios RRM1 y RRM2, y el dominio C-terminal RRM3. Seguidamente se resuelve la estructura por Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de cuatro de sus seis dominios RRM, identificando motivos estructurales novedosos en los dominios C-terminales de ambas proteínas . Además se realiza un análisis de la afinidad y selectividad por diferentes secuencias de ácidos nucleicos encontrando que de los tres dominios RRM que tiene cada proteína, el primero tiene un reconocimiento canónico de ácidos nucleicos, el segundo presenta una nueva interfase de interacción y el tercero no une ningún tipo de ácido nucleico. La comparación con datos recientemente publicados en la literatura muestran que el dominio RRM2 es similar al dominio RRM2 de la proteína SRSF1 humana y que se conserva el modo de reconocimiento de, al menos dos guaninas consecutivas. En una última sección se investiga la posible función del dominio RRM C-terminal descubriendo que constituye una pieza esencial en el reconocimiento del complejo THO, una estructura supramolecular clave para la transcripción y para el transporte núcleo-citoplasmático. Esta importante interacción se ha corroborado mediante el aislamiento y purificación de complejos in vivo utilizando la técnica de ¿Tandem Afinity Purification¿ (TAP). El análisis de la estructura del dominio RRM3 permite identificar una superficie altamente conservada que involucra al bucle 5 del dominio y encontrar su homólogo estructural en el dominio RRM1 de las proteínas humanas SRSF1 y 9, las cuales también interaccionan con THO/TREX. Estas proteínas tienen una función esencial en ¿splicing¿ alternativo, sin embargo, pese a la gran homología con ellas, los experimentos realizados en esta tesis y los datos existentes en la literatura descartan un papel de Gbp2p/Hrb1p en ¿splicing¿ de ARNm.
En el segundo capítulo se realiza un estudio del reconocimiento de ARN de los cuatro primeros motivos tipo dedo de zinc (Zf1-4) de la proteína Nab2p, esencial para el control de la cola de poliadeninas de los ARNm y para su transporte. Se cuantificó la afinidad por diversas sondas de ARNm mediante anisotropía de fluorescencia encontrándose que Nab2p Zf1-4 une con afinidad moderada (KD~2 ¿M) oligonucleótidos de polirriboadenosina A12. El estudio de la interacción por RMN no permite extraer conclusiones acerca de la superficie de interacción y por tanto del modo de reconocimiento. Para ello se realiza un diseño racional de mutantes a partir de información estructural de Nab2p y modos de interacción de proteínas similares. Estos estudios permiten identificar una hélice ¿ y el dedo de zinc 3 como las regiones más importantes para el reconocimiento de poli(A) en la región Zf1-4 y junto con información recientemente publicada para la región Zf5-7 por otros autores, proponer un modelo completo de reconocimiento de RNA por parte de Nab2p Zf1-7.
Por último, se analiza la interacción entre las proteínas Pub1p y Tif4631p. Ambas proteínas son homólogas a TIA-1 y eIF4G1 respectivamente, dos proteínas esenciales en el control posttranscripcional en organismos pluricelulares. Al igual que sus homólogas, Pub1p y Tif4631p resultan ser esenciales para el ensamblaje de algunos tipos de gránulos de estrés. En un primer estudio se determina que la región del dominio RRM3 de Pub1p interacciona con la zona N-terminal de Tif4631p. La interacción se corrobora de forma independiente mediante RMN y ensayos de entrecruzamiento. Seguidamente se caracteriza la región N-terminal de Tif4631p, encontrándose que está intrínsecamente desestructurada. La asignación del espectro de RMN de la construcción Tif4631p (1-184) permite realizar titulaciones por RMN con muestras de Pub1p RRM3 no marcadas e identificar las regiones de la primera, potencialmente involucradas en la interacción. Posteriormente un análisis similar utilizando Pub1p RRM3 marcada y péptidos derivados de Tif4631p confirma la interacción de dos de ellos. Uno de estos péptidos coincide un una región altamente conservada en Tif4631p que se demuestra tiene la capacidad de formar de hidrogeles. Además la interacción con Pub1p RRM3 parece modular este proceso de agregación, quizás, semejante al que ocurre en la formación de gránulos de estrés.
