Importancia de la cuantificación de ARN del virus para el diagnóstico y monitorización de la hepatitis delta

• Autores: Marta Illescas López
• Directores de la Tesis: Federico García García (codir. tes.), Adolfo de Salazar González (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2026
• Idioma: español
• ISBN: 9791370153212
• Número de páginas: 176
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen
  • español

    La presente tesis doctoral aborda uno de los principales retos actuales en el manejo clínico de la infección por el virus de la hepatitis D (VHD): la estandarización y optimización de su diagnóstico molecular. La hepatitis D constituye la forma más grave de hepatitis vírica crónica, asociándose a una progresión más rápida hacia cirrosis, descompensación hepática y hepatocarcinoma en comparación con la monoinfección por VHB. En este contexto, la correcta detección y cuantificación precisas del ARN del VHD resulta esencial. Sin embargo, el diagnóstico molecular del VHD presenta importantes limitaciones, entre ellas la falta de estandarización entre ensayos comerciales, la elevada variabilidad genética del virus y la ausencia de una armonización efectiva en la cuantificación, factores que pueden generar discrepancias clínicamente relevantes. El objetivo principal de esta tesis fue evaluar el rendimiento analítico y clínico de un nuevo ensayo comercial para la detección y cuantificación del ARN del VHD, comparándolo con otros métodos disponibles, así como analizar estrategias de optimización preanalítica que mejorasen la sensibilidad diagnóstica. Se llevó a cabo la comparación de tres ensayos comerciales en 151 muestras clínicas, observándose una total concordancia cualitativa entre los métodos. No obstante, el análisis cuantitativo reveló discrepancias sistemáticas entre plataformas. Aunque los coeficientes de correlación fueron elevados (r² entre 0,703 y 0,835), los análisis de Bland-Altman mostraron sesgos relevantes, con diferencias medias que alcanzaron hasta ±3 log entre algunos métodos. La comparación frente al Estándar Internacional confirmó variaciones constantes por sobreestimación o infraestimación, especialmente en concentraciones cercanas al límite de detección. En una segunda fase, se evaluó el impacto de un pretratamiento por choque térmico previo a la amplificación. En una cohorte de 130 muestras, el procedimiento mantuvo una alta concordancia cualitativa (97%) respecto al protocolo convencional, aunque permitió detectar ARN en cuatro muestras inicialmente negativas. Desde el punto de vista cuantitativo, el 78% de las muestras positivas experimentaron un incremento ≥1 log tras el choque térmico, siendo el efecto especialmente marcado en muestras con baja viremia. El análisis estadístico confirmó que el pretratamiento modifica significativamente la cuantificación y que, en su ausencia, la carga viral tiende a infraestimarse en aproximadamente una unidad logarítmica. En conjunto, los resultados de esta tesis demuestran que, aunque la concordancia cualitativa entre ensayos comerciales es excelente, las diferencias cuantitativas sistemáticas pueden tener implicaciones clínicas relevantes en la monitorización terapéutica. Asimismo, evidencian que la incorporación de un sencillo paso de choque térmico mejora de forma significativa la sensibilidad y la cuantificación del ARN del VHD, especialmente en viremias bajas. Estos hallazgos respaldan la necesidad de armonizar los métodos de cuantificación y de optimizar los procesos preanalíticos para garantizar una monitorización virológica más precisa, reproducible y clínicamente útil en la hepatitis D.

  • English

    This doctoral thesis addresses one of the main current challenges in the clinical management of hepatitis D virus (HDV) infection: the standardisation and optimisation of its molecular diagnosis. Hepatitis D represents the most severe form of chronic viral hepatitis being associated with a more rapid progression to cirrhosis, hepatic decompensation and hepatocellular carcinoma compared with HBV monoinfection. In this context, accurate detection and precise quantification of HDV RNA are essential both to confirm active infection and to monitor response to antiviral therapy. However, HDV molecular diagnosis presents important limitations, including the lack of standardisation among commercial assays, the high genetic variability of the virus, and the absence of effective harmonisation in viral load quantification, all of which may lead to clinically relevant discrepancies. The primary objective of this thesis was to evaluate the analytical and clinical performance of a novel commercial assay for the detection and quantification of HDV RNA, compared with other available methods, as well as to assess pre-analytical optimisation strategies aimed at improving diagnostic sensitivity. A comparative analysis of three commercial assays was performed in 151 clinical samples, demonstrating complete qualitative concordance between methods, with 100% sensitivity and specificity for the Vircell and EurobioPlex assays. Nevertheless, quantitative analysis revealed systematic discrepancies between platforms. Although correlation coefficients were high (r² ranging from 0.703 to 0.835), Bland–Altman analyses demonstrated relevant biases, with mean differences reaching up to ±3 log between certain methods. Comparison with the WHO International Standard confirmed consistent patterns of overestimation or underestimation depending on the assay employed, particularly at concentrations close to the lower limit of detection. In a second phase, the impact of a heat shock pre-treatment step prior to amplification was evaluated. In a cohort of 130 samples, this approach maintained high qualitative concordance (97%) compared with the conventional protocol and enabled HDV RNA detection in four samples that were initially negative. From a quantitative perspective, 78% of positive samples showed an increase of ≥1 log following heat shock treatment, with a particularly marked effect in low-level viraemia. Statistical analysis confirmed that the pre-treatment significantly modifies viral load quantification and that, in its absence, HDV RNA levels tend to be underestimated by approximately one logarithm. Overall, the findings of this thesis demonstrate that, although qualitative concordance between commercial assays is excellent, systematic quantitative differences may have clinically relevant implications for therapeutic monitoring. Furthermore, they show that the incorporation of a simple heat shock step significantly improves the sensitivity and quantification of HDV RNA, particularly in low-level viraemia. These results support the need to harmonise quantification methods and to optimise pre-analytical processes in order to ensure more accurate, reproducible and clinically meaningful virological monitoring in hepatitis D.