Investigación de mecanismos celulares, fisiológicos y moleculares de la biotransformación de selenio por Stenotrophomonas bentonitica BII-R7: aplicaciones en biotecnología ambiental y síntesis verde de nanomateriales

• Autores: Guillermo Lazuén López
• Directores de la Tesis: Mohamed Larbi Merroun (codir. tes.), Margarita López Fernandez (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2026
• Idioma: español
• ISBN: 9791370152857
• Número de páginas: 419
• Títulos paralelos:
  • Investigation of cellular, physiological, and molecular mechanisms of selenium biotransformation by Stenotrophomonas bentonitica BII-R7: applications in environmental biotechnology and gren synthesis of nanomaterials
• Menciones:
  • Internacional
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen
  • español

    El selenio (Se) es un metaloide de distribución heterogénea en el medio ambiente que desempeña un papel dual desde el punto de vista biológico y ambiental. A bajas concentraciones, actúa como elemento traza esencial, mientras que a niveles superiores se vuelve altamente tóxico con un margen muy estrecho entre la dosis beneficiosa y la perjudicial. Su toxicidad depende del estado de valencia, destacando el selenito [Se(IV)] y el selenato [Se(VI)] por su elevada movilidad y biodisponibilidad, esto los convierte en los principales estados de oxidación responsables de la contaminación de suelos y aguas asociada a actividades mineras, agrícolas e industriales. Estos oxoaniones inducen estrés oxidativo, daño en el material genético y alteraciones metabólicas. La reducción microbiana del selenio constituye un mecanismo natural de detoxificación y un proceso de interés biotecnológico, al permitir la transformación de Se(IV) y Se(VI) en selenio elemental [Se(0)] y seleniuro [Se(−II)], formas menos solubles y biológicamente menos disponibles. En este contexto, Stenotrophomonas bentonitica BII-R7 se presenta como un modelo idóneo para estudiar la biotransformación del selenio y desarrollar estrategias sostenibles de biorremediación y síntesis verde de nanomateriales. En una primera fase, se llevó a cabo un análisis citotóxico, fisiológico y bioquímico del efecto de Se(IV) y Se(VI) sobre S. bentonitica BII-R7, que permitió identificar dos trayectorias fisiológicas claramente diferenciadas, estrechamente dependientes del estado redox de cada oxoanión y de la estructura de los productos de reducción generados La exposición a Se(IV) (0,25–2 mM) indujo una respuesta adaptativa progresiva caracterizada por un incremento de la toxicidad dependiente de la dosis y del tiempo de exposición (24–144 horas). Se observó un descenso de la viabilidad celular asociado a una hiperpolarización sostenida de la membrana, indicativa de activación metabólica, junto con un aumento gradual de especies reactivas de oxígeno (ROS) y una acidificación intracelular controlada (pHᵢ). Estos cambios se acompañaron de una leve depleción de Ca²⁺ intracelular, una reducción moderada de la integridad del ADN y un aumento compensatorio del ARN, reflejando una respuesta transcriptómica orientada a la activación de mecanismos de defensa metabólica y reparación celular. A nivel enzimático, la succinato deshidrogenasa (SDH) mostró una activación transitoria, mientras que la catalasa (CAT) presentó una inducción sostenida asociada a la presencia de ROS, evidenciando un estado de estrés oxidativo crónico pero tolerable. Este equilibrio permitió mantener la homeostasis redox y canalizar electrones hacia la reducción de Se(IV) a Se(0), confirmada por la formación inicial de nanopartículas de selenio (SeNPs) amorfas intracelulares (24 horas). Estas SeNPs evolucionaron hacia nanoestructuras cristalinas extracelulares (48–72 horas), que fueron siendo predominantemente trigonales (144 horas), mediante una transición alotrópica ordenada y metabólicamente controlada. En contraste, la exposición a Se(VI) (50–200 mM) desencadenó una respuesta citotóxica aguda y bifásica, distinguiéndose fases tempranas (2–18 horas) y tardías (28–68 horas). Estos efectos fueron especialmente notables a concentraciones elevadas, caracterizándose por un descenso brusco de la viabilidad celular a partir de 100 mM, una hiperpolarización extrema de la membrana, una acumulación explosiva de ROS y una acidificación citoplasmática severa. Estas alteraciones se asociaron a una degradación temprana del ADN y a un aumento transitorio del ARN en las primeras horas, relacionándolo con una respuesta transcripcional frente a una sobrecarga redox letal. A nivel estructural, se observó la formación directa de nanotubos cristalinos de SeNPs (28–68 horas) sin pasar por nanoesferas amorfas, lo que evidencia mecanismos moleculares de defensa y cristalización distintos de los implicados en la reducción de Se(IV). Estos resultados motivaron el desarrollo posterior de un análisis proteómico para identificar las proteínas responsables de la reducción de Se(VI) y la formación de Se(0). El análisis subcelular de S. bentonitica BII-R7 frente a Se(VI) mostró que tanto el citoplasma como la fracción de membrana total son capaces de reducir este oxoanión a SeNPs, incluso en ausencia de NADH, lo que evidencia la coexistencia de rutas enzimáticas dependientes e independientes de donadores externos de electrones. Sin embargo, la separación de las membranas interna y externa reveló que, de forma aislada, carecen de capacidad reductora indicando que la reducción efectiva de Se(VI) requiere la integración funcional de los distintos compartimentos de membrana. La reducción se asoció a la formación de SeNPs con morfologías esféricas de naturaleza amorfa, lo que sugiere la participación de múltiples mecanismos de nucleación y estabilización. Asimismo, la ausencia de estructuras cristalinas organizadas en las fracciones subcelulares indica que la transición alotrópica depende del funcionamiento coordinado de la célula completa. El análisis proteómico diferencial evidenció una profunda reprogramación metabólica asociada a la reducción de Se(VI).

  • English

    Selenium (Se) is a metalloid heterogeneously distributed in the environment that plays a dual biological and environmental role: it is an essential trace element at low concentrations, but it becomes highly toxic at higher levels, with a very narrow margin between beneficial and harmful doses. Selenium toxicity strongly depends on its oxidation state, with selenite [Se(IV)] and selenate [Se(VI)] standing out due to their high mobility and bioavailability, which make them the main oxidation states responsible for soil and water contamination associated with mining, agricultural, and industrial activities. These oxyanions induce oxidative stress, genetic damage, and metabolic disturbances. Microbial selenium reduction constitutes a natural detoxification mechanism and a process of considerable biotechnological interest, as it enables the transformation of Se(IV) and Se(VI) into elemental selenium [Se(0)] and selenide [Se(−II)], which are less soluble and biologically less accessible forms. In this context, Stenotrophomonas bentonitica BIIR7 emerges as an ideal bacterial model to investigate selenium biotransformation and to develop sustainable strategies for environmental bioremediation and green synthesis of nanomaterials. In an initial phase, a cytotoxic, physiological, and biochemical analysis of the impact of Se(IV) and Se(VI) on Stenotrophomonas bentonitica BII-R7 was performed, revealing two distinct physiological trajectories closely linked to the redox state of each oxyanion and to the structure of the resulting reduction products. Exposure to Se(IV) (0.25–2 mM) induced a progressive adaptive response characterized by a dose- and time-dependent increase in toxicity over exposure periods ranging from 24 to 144 hours. A decrease in cell viability was associated with sustained membrane hyperpolarization, indicative of metabolic activation, a gradual increase in reactive oxygen species (ROS), and a controlled intracellular acidification (pHᵢ), dependent on both concentration and exposure time. These changes were accompanied by a mild depletion of intracellular Ca²⁺, a moderate reduction in DNA integrity, and a compensatory increase in RNA levels, reflecting a transcriptomic response that activates metabolic defense and cellular repair mechanisms. At the enzymatic level, succinate dehydrogenase (SDH) exhibited transient activation, while catalase (CAT) showed sustained induction in response to ROS, indicating a state of chronic but tolerable oxidative stress. This balance allowed the maintenance of redox homeostasis and the channelling of electrons toward the reduction of Se(IV) to Se(0), confirmed by the initial formation of intracellular amorphous selenium nanoparticles (SeNPs) at 24 hours, which subsequently evolved into extracellular crystalline nanostructures (48–72 hours), predominantly trigonal at 144 hours, through an ordered and metabolically controlled allotropic transition. In contrast, exposure to Se(VI) (50–200 mM) triggered an acute and biphasic cytotoxic response, distinguishing early (2–18 hours) and late (28–68 hours) phases. These effects were particularly pronounced at higher concentrations, characterized by a sharp decline in cell viability above 100 mM, extreme membrane hyperpolarization, explosive ROS accumulation, and severe cytoplasmic acidification. These responses were associated with early DNA degradation and a transient increase in RNA levels during early exposure times, consistent with a transcriptional response to lethal redox overload. Structurally, the direct formation of crystalline SeNPs nanotubes was observed at later stages without amorphous intermediates, indicating molecular defense and crystallization mechanisms distinct from those involved in Se(IV) reduction. These findings motivated the subsequent development of a proteomic analysis to identify the proteins responsible for Se(VI) reduction and Se(0) formation. The subcellular analysis of S. bentonitica BII-R7 exposed to Se(VI) showed that both the cytoplasmic and total membrane fractions can reduce this oxyanion to selenium nanoparticles (SeNPs), even in the absence of NADH, indicating the coexistence of enzymatic pathways that are dependent and independent of external electron donors. However, the separation of the inner and outer membranes revealed that, when isolated, they lack reductive capacity, indicating that effective Se(VI) transformation requires the functional integration of different cellular compartments. Reduction was associated with the formation of amorphous SeNPs with spherical morphologies, suggesting the involvement of multiple nucleation and stabilization mechanisms. Furthermore, the absence of organized crystalline structures in subcellular fractions indicates that the allotropic transition depends on the coordinated functioning of the intact cell. Differential proteomic analysis revealed a profound metabolic reprogramming associated with Se(VI) reduction. In the cytoplasm, repression of succinate dehydrogenase and activation of isocitrate dehydrogenase suggest a reorganization of the Krebs cycle aimed at reinforcing glutamate and glutathione biosynthesis, thereby linking energy metabolism to the redox response.