Design, production and characterization of protein-based fusion inhibitors against SARS-CoV-2 and HIV-1

• Autores: Daniel Polo Megías
• Directores de la Tesis: Francisco Conejero Lara (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2026
• Idioma: inglés
• ISBN: 9791370152666
• Número de páginas: 290
• Menciones:
  • Internacional
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen
  • español

    Los virus zoonóticos continúan representando una amenaza persistente para la salud global, tal y como evidencian las pandemias causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el SARS-CoV-2. A pesar de los notables avances logrados hasta la fecha, aún no existen vacunas efectivas ni tratamientos curativos contra el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la aparición de variantes resistentes sigue desafiando las terapias antirretrovirales (ART) actuales. De forma similar, aunque las vacunas contra la COVID-19 han mostrado una gran eficacia, la pérdida progresiva de inmunidad y la evolución del virus ponen de manifiesto la necesidad de desarrollar estrategias antivirales complementarias. En este contexto, resulta fundamental el desarrollo de enfoques de amplio espectro dirigidos a mecanismos conservados esenciales para la entrada de estos virus. Tanto el VIH como el SARS-CoV-2 dependen de glucoproteínas de fusión de clase I —Envuelta (Env) y Spike (S), respectivamente— que median la entrada del virus mediante un proceso de fusión de membranas. Este proceso implica la formación de un haz de seis hélices (6HB) entre las regiones conservadas de repeticiones hepta-repetidas 1 y 2 (HR1 y HR2). Además, interacciones adicionales que involucran la región proximal al péptido de fusión (FPPR) y la región externa proximal a la membrana (MPER) contribuyen a estabilizar el complejo de fusión y a facilitar la unión de las membranas. Dado que este paso es esencial para la infección viral, constituye un objetivo terapéutico atractivo y numerosas estrategias inhibidoras se han centrado en interferir con esta interacción, incluyendo el uso de péptidos derivados de HR1 y HR2, análogos modificados de estos, anticuerpos monoclonales (mAbs) e inhibidores de molécula pequeña. Una alternativa prometedora, desarrollada por el grupo de investigación en el que se enmarca esta tesis doctoral, consiste en el uso de proteínas miméticas de HR1 de cadena única (denominadas covNHR) dirigidas contra la región HR2 de gp41 de VIH. Estas proteínas pueden producirse eficientemente en bacterias, se unen con alta afinidad a péptidos derivados de HR2 y son capaces de inhibir la infección por VIH in vitro. Versiones truncadas que comprenden solo la mitad N-terminal de HR1 (covNHR-N) también mantienen la capacidad inhibidora contra el VIH. De forma llamativa, la estabilización mediante puentes disulfuro de estas proteínas (covNHR-N-dSS) incrementa notablemente su capacidad neutralizante. Basándose en esta estrategia, la primera parte de la tesis se centró en aumentar la estabilidad conformacional de la variante covNHR-N-dSS mediante la introducción de mutaciones de tipo polar a hidrofóbico. Además, esta nueva mini proteína hiper estable se empleó como base para incorporar residuos adicionales de la FPPR implicados en las interacciones con la MPER, una región reconocida por diversos anticuerpos ampliamente neutralizantes (bNAbs). Estas modificaciones mejoraron tanto la estabilidad como la actividad antiviral, generando constructos con niveles de neutralización comparables a los obtenidos con las variantes largas de covNHR, terapias antirretrovirales combinadas y bNAbs conocidos. Asimismo, se observó una fuerte sinergia con bNAbs y una reducción significativa de la replicación del VIH-1 en ensayos ex vivo, lo que refuerza el potencial terapéutico de las nuevas variantes covNHR. La segunda parte del trabajo extendió el concepto de covNHR al SARS-CoV-2 mediante el diseño de una primera generación de proteínas miméticas de HR1 (denominadas proteínas CoVS-HR1). Se diseñaron cuatro variantes: dos que abarcan la región completa de HR1 (CoVS-HR1-L1 y CoVS-HR1-L2) y dos que corresponden a sus mitades N- y C-terminales (CoVS-HR1-N y CoVS-HR1-C, respectivamente). Todas las variantes fueron producidas con éxito y mostraron las estructuras α-helicoidales esperadas. Demostramos que la infección celular de SARS-CoV-2 puede ser bloqueada por estas proteínas, aunque su heterogeneidad conformacional y tendencia a la oligomerización limitó con bastante seguridad la afinidad de unión a péptidos de HR2 y su actividad inhibitoria in vitro. Con este trabajo, se identificó el subdominio N-terminal como la principal región de unión a HR2, aunque este se caracteriza por una estabilidad intrínseca muy reducida y baja afinidad por HR2. Para superar las limitaciones observadas en esta primera generación de proteínas CoVSHR1, la tercera parte de la tesis se centró en optimizar las mini proteínas CoVS-HR1-N y CoVS-HR1-C mediante diversas estrategias de diseño racional. En comparación con los constructos iniciales, esta segunda generación de mini proteínas mostró propiedades biofísicas notablemente mejores en términos de estabilidad térmica y estado de oligomerización. Los ensayos de unión e inhibición confirmaron el papel predominante del subdominio N-terminal de HR1 en la interacción con HR2 y en la inhibición viral, mientras que la región C-terminal permaneció inactiva. No obstante, experimentos adicionales con construcciones completas de CoVS-HR1 y péptidos HR2 de distintas longitudes revelaron una distribución cooperativa de la energía de interacción a lo largo de toda la interfaz HR1– HR2. En concordancia con los resultados obtenidos en VIH, se observó también una clara correlación entre la estabilidad conformacional y la potencia antiviral de las proteínas. Finalmente, la última parte de la tesis exploró el uso de la versión CoVS-HR1 larga más optimizada (CoVS-HR1-L3C, o L3C) como inmunógeno para generar anticuerpos de dominio único (por sus siglas en inglés, sdAbs) o “nanobodies® (NBs)” dirigidos frente a la región HR1. La inmunización de una alpaca con L3C produjo un conjunto inicial de ocho NBs que, curiosamente, se unían exclusivamente a la región C-terminal; con dos de ellos mostrando una inhibición viral moderada. Dada la relevancia funcional del dominio Nterminal de HR1 en el reconocimiento de HR2, se empleó posteriormente una variante truncada optimizada que mimetiza esta región (CoVS-HR1-N2C) como antígeno para aislar un segundo conjunto de tres NBs. Sin embargo, ninguno de ellos mostró una inhibición detectable, probablemente debido a su baja afinidad de unión. Aun así, se encontraron efectos de unión cooperativa entre NBs de ambos conjuntos, lo que evidencia la viabilidad de desarrollar constructos biparatópicos potencialmente más afines. Además, la estructura cristalográfica de un complejo ternario formado por dos NBs unidos a HR1 reveló dos nuevos epítopos inmunogénicos dentro de esta conservada región. En conjunto, los resultados de esta tesis doctoral refuerzan el potencial de las terapias dirigidas contra la interacción HR1–HR2 para impedir la formación del 6HB, un paso crítico en el mecanismo de fusión compartido por numerosos virus envueltos, proporcionando una base sólida para el diseño racional de inhibidores de fusión de nueva generación.

  • English

    Zoonotic viruses remain a persistent threat to global health, as exemplified by the HIV and SARS-CoV-2 pandemics. Despite significant advances, effective vaccines or curative treatments for AIDS are still lacking, and the emergence of resistant variants continues to challenge current antiretroviral therapy (ART). Likewise, although SARS-CoV-2 vaccines have proven highly effective, waning immunity and viral evolution highlight the need for complementary antiviral approaches. These challenges emphasize the importance of developing broad-spectrum strategies targeting conserved mechanisms essential for viral entry and fusion. Both HIV and SARS-CoV-2 rely on class I fusion glycoproteins—Envelope (Env) and Spike (S), respectively—that mediate viral entry through a membrane fusion process involving the formation of a six-helix bundle (6HB) between the conserved heptad repeat regions 1 and 2 (HR1 and HR2). Additional interactions involving the fusion peptide proximal region (FPPR) and the membrane-proximal external region (MPER) further stabilize the fusion complex and facilitate membrane merger. This step represents an attractive therapeutic target, and numerous inhibitory approaches have focused on disrupting this interaction, mainly including peptides derived from HR1 and HR2, engineered peptide analogues, monoclonal antibodies (mAbs), and small-molecule inhibitors. A promising alternative, developed by the research group in which this doctoral work was conducted, involves the use of single-chain HR1 mimetic proteins (termed covNHR) to target the HR2 region of HIV gp41. These proteins can be efficiently produced in bacteria, bind HR2-derived peptides with high affinity, and inhibit HIV infection in vitro. Truncated variants comprising only the N-terminal half of the HR1 region (covNHR-N) also retain inhibitory capacity against HIV-1. Notably, stabilization through engineered disulfide bonds of these proteins (covNHR-N-dSS) markedly improves their neutralization potency. Building upon this strategy, the first part of the thesis aimed to further increase the conformational stability of the covNHR-N-dSS variant by introducing polar-to-hydrophobic core mutations. Additionally, this new hyperstable miniprotein was employed as a scaffold to graft additional FPPR residues involved in interactions with MPER, a region recognized by several broadly neutralizing antibodies (bNAbs). These modifications enhanced stability and antiviral activity, yielding constructs with neutralization levels comparable to the long covNHR variants, combined ART protocols, and known bNAbs. Moreover, a strong synergy with bNAbs and a reduction of HIV-1 replication in ex vivo assays underscored their therapeutic potential. The second part of this work extended the covNHR concept to SARS-CoV-2 through the design of a first generation of HR1 mimetic proteins (termed CoVS-HR1 proteins). Four variants were initially designed: two encompassing the entire HR1 region (CoVS-HR1-L1 and CoVS-HR1-L2), and two corresponding to its N- and C-terminal halves (CoVS-HR1-N and CoVS-HR1-C, respectively). All variants were successfully produced and showed α-helical structures. We demonstrated that SARS-CoV-2 cell infection can be blocked by these CoVS- HR1 proteins, although their conformational heterogeneity and oligomerization likely limited the binding affinity for HR2 peptides and in vitro inhibition potential. With this work, the N-terminal subdomain was identified as the main HR2-binding region, but it did not show inhibitory activity due to its low intrinsic stability and poor affinity for HR2. To address the limitations identified in the first generation of CoVS-HR1 proteins, the third part of this thesis focused on their optimization—particularly, of the CoVS-HR1-N and CoVS-HR1-C miniproteins—through a series of rational design strategies. Compared to the initial constructs, this second generation of miniproteins exhibited markedly improved biophysical properties in terms of thermal stability and oligomerization state. Binding and inhibition assays confirmed the predominant role of the N-terminal HR1 subdomain in mediating HR2 interaction and viral inhibition, while the C-terminal region remained inactive. Nonetheless, binding and inhibition experiments revealed a cooperative distribution of interaction energy along the entire HR1–HR2 interface. Consistent with findings in HIV, a clear correlation between conformational stability and antiviral potency was also observed. Finally, in the last part of this doctoral thesis, we explored the use of the most optimized long CoVS-HR1 candidate (CoVS-HR1-L3C, or L3C) as an immunogen to generate single-domain antibodies (sdAbs), or nanobodies® (NBs), targeting the HR1 region. Immunization of an alpaca with L3C yielded an initial set of eight NBs which interestingly targeted exclusively the C-terminal region, and two of them moderately inhibited viral infection. Given the functional importance of the HR1 N-terminal subdomain in HR2 recognition, an optimized truncated variant mimicking this region (CoVS-HR1-N2C) was subsequently employed as an antigen to isolate a second set of three NBs. However, none of them exhibited detectable viral inhibition, likely due to their low binding affinities, but cooperative binding effects between NBs from both sets suggest the feasibility of biparatopic constructs with potencially enhanced efficacy. Furthermore, the crystallographic structure of a ternary complex of two NBs bound to HR1 revealed two novel immunogenic epitopes within this conserved fusion core. Overall, the findings of this doctoral thesis reinforce the potential of targeting the conserved HR1–HR2 interface to disrupt 6HB formation, a critical step in the fusion mechanism shared by diverse enveloped viruses, providing a solid foundation for the rational design of next-generation fusion inhibitors.