Nuevas estrategias basadas en la terapia NKG2D-CAR T para el tratamiento del osteosarcoma
- Autores: Patricia García Rodríguez
- Directores de la Tesis: Javier García Castro (dir. tes.), Laura Hidalgo Lumbreras (codir. tes.)
- Lectura: En la UNED. Universidad Nacional de Educación a Distancia ( España ) en 2026
- Idioma: español
- Número de páginas: 227
- Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Roberto Rodríguez Madoz (presid.), Margarita González-Vallinas Garrachón (secret.), Andoni Garitano Trojaola (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas y Salud Pública por la Universidad Nacional de Educación a Distancia
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
El osteosarcoma (OS) es la neoplasia maligna ósea más frecuente, que afecta principalmente a adolescentes y adultos jóvenes. El tratamiento estándar combina la resección quirúrgica con quimioterapia multifármaco. Sin embargo, debido a las limitaciones de los tratamientos convencionales, la tasa de supervivencia es inferior al 20% en pacientes con enfermedad metastásica y recaída. Por tanto, existe la necesidad de investigar nuevas opciones terapéuticas para mejorar el pronóstico de los pacientes. La terapia con células T modificadas para expresar receptores de antígeno quimérico (CAR T) ha demostrado respuestas clínicas significativas en neoplasias hematológicas. Sin embargo, su eficacia en tumores sólidos, como el OS, sigue siendo limitada. Los principales factores que influyen en la escasa eficacia de la terapia CAR T en tumores sólidos incluyen la heterogeneidad de los antígenos tumorales y un microambiente funcional (TME) hostil, caracterizado por hipoxia y la presencia de células mieloides inmunosupresoras. En este trabajo, utilizamos células CAR T basadas en el receptor NKG2D, capaz de reconocer múltiples ligandos que se expresan en las células tumorales de OS.
Los primeros resultados del estudio mostraron una elevada citotoxicidad in vitro de las células NKG2D-CAR T frente al OS, incluso con baja proporción de células terapéuticas. Por el contrario, su eficacia en modelos in vitro fue limitada. Para abordar la disfuncionalidad de los linfocitos NKG2D-CAR T en el entorno vivo. se evaluaron dos enfoques principales: la modificación intrínseca de las células T y la remodelación extrínseca TME. El objetivo principal de esta tesis es mejorar la eficacia de la terapia con células NKG2D-CAR T mediante estrategias innovadoras que aborden las principales limitaciones presentes en los OS.
Inicialmente, se exploró el impacto de la sobreexpresión de la proteína LIN28, un regulador negativo de la familia de miARNlet-7, en la funcionalidad de los linfocitos T humanos aplicados a la terapia CAR T. Esta modificación buscaba mejorar la funcionalidad, la viabilidad, la expansión y la citotoxicidad de las células NKG2D-CAR T humanas. Aunque se logró la sobreexpresión estable de LIN28 y la reducción de los niveles de let-7, nuestros resultados revelaron que la modulación del eje LIN28/let-7 no mejoró la capacidad proliferativa ni el fenotipo celular estudiado. Por el contrario, la sobreexpresión de LIN28 resultó contraproducente, ya que se observó una disminución de la capacidad antitumoral de las células NKG2D-CAR T tanto in vitro con in vivo. Estos resultados subrayan la compleja interacción entre el eje LIN28/let-7 y la funcionalidad de las células CAR T humanas.
Paralelamente, se investigó si factores externos característicos del TME del OS limitaban la eficacia de la terapia NKG2D-CAR T observada previamente in vivo. En primer lugar, se caracterizaron los xenoinjertos de dos modelos murinos de OS y se observó una expresión generalizada de HIF-1α en los cortes de los tumores analizados. Por ello, se examinó em impacto de la hipoxia en la funcionalidad in vitro de las células NLG2D-CAR T. En nuestro estudio, se establecieron modelos celulares con niveles de oxigeno reducidos (1% de O2) y se demostró que no alteraba la expresión de los ligandos diana en las células tumorales. Observamos que los niveles de oxígeno limitados no comprometían el fenotipo ni la capacidad efectora de las células KNG2D-CAR T en modelos bidimensionales y esferoides. Incluso después de cuatro ciclos de reestimulación antigénica seriada, la funcionalidad de las células NKG2D-CAR T en condiciones hipóxicas se mantuvo similar a la actividad citotóxica en condiciones de normoxia. Por lo tanto, la resistencia terapéutica no se debe únicamente a la falta de oxigeno, sino probablemente a su interacción con otros cambios metabólicos o células inmunes del TME, como las subpoblaciones mieloides.
En este estudio, optimizamos un protocolo de diferenciación y polarización de macrófagos para estudiar in vitro la interacción con la terapia KNG2D-CAR T en un contexto tumoral. Los análisis in vitro indican que la polarización de los macrófagos hacia un fenotipo M1 incrementa la actividad antitumoral de la terapia NKG2D-CAR T en comparación con los macrófagos polarizados hacia M2 que restringieron parcialmente la actividad citotóxica. Se determinó que esta respuesta está mediada principalmente por los factores solubles secretados en el cocultivo.
Ante estos resultados, la investigación se orientó hacia una estrategia combinatoria que indujera un profundo cambio en el TME que mejorase la respuesta antitumoral. En este sentido utilizamos una terapia combinada con NKG2D-CAR T y adenovirus oncolíticos armados con transgenes. Se utilizaron tres variantes de adenovirus que derivan del ICOVIR-15K (OAd), OAd MICA (sobreexpresando una variante no soluble de MICA) y AOAd (CXCL 10, IL-15 y la variante no soluble de MICA). Todos mostraron un efecto citopático similar y las infecciones con los virus pertinentes mostraron un incremento de expresión de los transgenes in vitro e in vivo. Aunque nuestros resultados indicaron que la citotoxicidad mediada por células NKG2D-CAR T comprometía la capacidad del adenovirus para completar su ciclo replicativo y liberar progenie oncolítica, demostramos que esta combinación remodela las subpoblaciones mieloides del TME y aumenta la secreción de citoquinas proinflamatorias asociadas con la migración y regulación del infiltrado en leucocitos. Además, la combinación prolonga la supervivencia de los modelos de OS establecidos, incluso con una carga tumoral elevada. Este trabajo evidencia que la combinación de células NKG2D-CAR T con virus oncolíticos constituye una estrategia prometedora para ofrecer alternativas terapéuticas a los pacientes con OS.
Por último, se desarrolló un modelo inmunocompetente de la terapia NKG2D-CAR T para estudiar más en profundidad el impacto del TME en los tumores de OS. En primer lugar, se confirmó la expresión de los ligandos de NKG2D-CAR T murios en las líneas de OS y de diseño el CAR del modelo singénico para generar las denominadas células mKNG2D- CAR T. Al final de la producción, las células mKNG2D-CAR T mostraron un fenotipo predominante de memoria efectora y demostraron una alta capacidad in vitro para eliminar las células tumorales y secretar citoquinas proinflamatorias. En el modelo in vivo, inocularemos la terapia en ratones C57BL/6 sin tumor y no observamos toxicidad. Sin embargo, en el modelo BALB/c singénico generado se observó toxicidad grave, con pérdida de peso drástica en 48 horas. Esta toxicidad se asoció con un aumento masivo de citoquinas y una reprogramación sistemática de las células mieloides hacia un estado proinflamatorio.
La realización de esta tesis destaca que la resistencia de la terapia CAR T en los tumores sólidos, y específicamente en OS, posiblemente no se deba a una barrera única, sino a una combinación de variables interdependientes que limitan su eficacia. Como perspectiva futura, se propone desplazar el foco del ataque exclusivo a la célula tumoral hacia un enfoque que remodele integralmente el TME, favoreciendo una retroalimentación positiva del ciclo de la inmunidad del cáncer. De esta manera, se podrá desarrollar un tratamiento que desencadene una respuesta antitumoral y memoria inmunológica que mejore el pronóstico de los pacientes con OS.
