Structural and functional characterization of SARS-CoV-2 envelope proteins
- Autores: Juan Ortiz Mateu
- Directores de la Tesis: Ismael Mingarro Muñoz (codir. tes.), Luis Martínez Gil (codir. tes.), Manuel Mateo Sánchez del Pino (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2026
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 165
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jose Luis Nieva Escadón (presid.), Pilar Domingo Calap (secret.), Dirk Schneider (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
- Menciones:
- Internacional
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- català
La present tesi investiga els mecanismes moleculars subjacents a la biogènesi i funció de dues proteïnes clau de l’embolcall del SARS-CoV-2: la proteïna de membrana (M) i la glicoproteïna Spike (S). Aquests dos components estructurals són essencials per a l’assemblatge i l’entrada viral, encara que les seues regions incrustades en la membrana i les seues vies de biogènesi continuen estant escassament caracteritzades. En les cèl·lules eucariotes, les proteïnes de membrana s’insereixen co-traduccionalment en el reticle endoplasmàtic (RE) mitjançant l’acció coordinada del translocó Sec61 i una xarxa d’insertases auxiliars, que inclouen el complex de membrana del RE (EMC) i el recentment identificat translocó multipàs (MPT). Comprendre com les proteïnes virals exploten aquestes maquinàries proporciona una visió fonamental de l’assemblatge del coronavirus i de les interaccions virus–hoste. El primer capítol se centra en la proteïna M: una xicoteta glicoproteïna amb tres TMDs que actua com el principal director de la morfogènesi del virió. Mitjançant una anàlisi de perfil de força (Force Profile Analysis, FPA) en E. coli es van revelar tres pics discrets de força corresponents a la inserció co-traduccional dels TMDs, seguits del plegament del domini soluble C-terminal. La topologia de membrana de les variants truncades va confirmar la seua inserció seqüencial. Mitjançant sistemes de complementació bimolecular es van mapar les interaccions TMD–TMD: el TMD2 actua com a organitzador central, mediant contactes amb TMD1 i TMD3 i permetent l’oligomerització precoç, mentre que simulacions de dinàmica molecular van identificar un clúster hidrofòbic de quatre residus que estabilitza la interfície dimèrica. La disrupció d’aquest clúster afecta l’oligomerització de M, el seu plegament i la dimerització co-traduccional, la interacció M–S i la formació de partícules víriques (VLPs), demostrant que l’estabilitat del dímer és crucial per a l’assemblatge del virió.Mitjançant marcatge de proximitat es caracteritzà a més el proteoma veïnal de M, revelant associacions dinàmiques amb insertases del RE com EMC, PAT i GEL, cosa que suggereix un mecanisme cooperatiu per a la inserció seqüencial dels seus tres TMDs. A més, l’enriquiment en xaperones luminals i en el complex de glicosilació OST-B apunta a una xarxa de control de qualitat del RE que estabilitza el plegament de M. En conjunt, es definí un model per a la biogènesi de la proteïna M en cèl·lules humanes. El segon capítol examina el paper del TMD de S en l’entrada viral. La proteïna S és una proteïna de membrana de tipus I que mitja el reconeixement de la cèl·lula diana i la fusió de membranes. Encara que el seu TMD es considerava tradicionalment un ancoratge passiu al virió, evidències recents suggereixen que els TMDs exerceixen sovint papers actius en la funció de les proteïnes de fusió virals. S’avaluà l’impacte en l’activitat de la proteïna S d’una sèrie de substitucions i insercions d’aminoàcids dins del nucli hidrofòbic del TMD. Els resultats revelen que la proteïna S és susceptible a alteracions en el seu TMD, i que les característiques de seqüència i estructura crítiques per a l’entrada viral estan distribuïdes al llarg de tot el domini, amb una contribució més pronunciada de la seua regió N-terminal. També es demostra que l’orientació relativa de les regions que flanquegen el TMD influeix en l’entrada viral. Finalment, les dades suggereixen que el TMD mitja l’homo-oligomerització a través d’un motiu enriquit en residus menuts, cosa que subratlla la seua importància funcional més enllà del simple ancoratge a la membrana. En conjunt, aquest treball proporciona un marc comprensiu que descriu com dues proteïnes de l’embolcall del SARS-CoV-2 interaccionen amb la maquinària de biogènesi de membranes de l’hoste i com característiques transmembrana específiques determinen les seues propietats estructurals i funcionals. Integrant aproximacions bioquímiques, cel·lulars i proteòmiques, aquesta tesi amplia la nostra comprensió dels mecanismes d’assemblatge i fusió del coronavirus, i identifica possibles dianes moleculars per a la intervenció antiviral.
- English
This thesis investigates the molecular mechanisms governing the biogenesis and functional properties of two essential SARS-CoV-2 envelope components: the Membrane (M) protein and the transmembrane domain (TMD) of the Spike (S) glycoprotein. These proteins are central to virion assembly and viral entry, yet their membrane-embedded regions and maturation pathways remain insufficiently characterized.
In eukaryotic cells, multipass membrane proteins insert co-translationally into the endoplasmic reticulum (ER) via the Sec61 translocon and a network of auxiliary insertases, including the ER membrane complex (EMC) and the recently described multipass translocon (MPT). Understanding how SARS-CoV-2 proteins exploit these pathways provides key insight into coronavirus assembly and host;virus interactions.The first part of the work focuses on the M protein, a small three-TMD glycoprotein that orchestrates virion morphogenesis.
Force Profile Analysis in E. coli revealed three distinct peaks corresponding to the co-translational insertion of each TMD, as well as a folding event in the C-terminal domain suggestive of dimerization occurring during translation. Topology analyses of constructs truncated after each TMD confirmed their sequential membrane insertion.TMD-TMD interaction mapping using bimolecular complementation systems identified TMD2 as the central organizing helix, mediating contacts with both TMD1 and TMD3 and enabling early oligomerization. Molecular-dynamics simulations revealed a hydrophobic four-residue cluster that stabilizes the dimer interface. Mutational disruption of this cluster weakened M oligomerization, impaired folding, reduced interaction with Spike, and diminished virus-like particle production, demonstrating that M dimer stability is essential for assembly and budding.A proximity-labeling proteomic approach characterized the local interactome of M in human cells. M was found in close proximity to various ER insertases including components of the EMC, PAT, and GEL complexes;supporting a coordinated, stepwise insertion pathway for its three TMDs. Enrichment of OST-B subunits aligned with the known dependence of M Nterminal glycosylation on this complex. Additionally, proximity to ER luminal chaperones suggested an ER quality-control system assisting in stabilizing the folded M dimer. Together, these results establish a comprehensive model of M biogenesis in human cells.The second part examines the functional relevance of the S TMD in viral entry. While the Spike protein is well studied for its receptor-binding and fusion roles, its TMD has traditionally been considered a passive membrane anchor. This work challenges that view by introducing targeted substitutions and insertions within the hydrophobic core of the TMD and assessing their impact on Spike activity. The results demonstrate that the S protein is highly sensitive to perturbations within its TMD: functional determinants are distributed across the domain, with a particularly strong contribution from its N-terminal region. Furthermore, alterations that changed the orientation of the luminal and cytosolic regions flanking the TMD impaired viral entry, underscoring the structural importance of the TMD. The data also support a role for the TMD in mediating homooligomerization through a motif enriched in small residues.Collectively, this thesis provides an integrated framework describing how two SARS-CoV-2 envelope proteins engage the host membrane biogenesis machinery, how their transmembrane features shape their structure and function, and how these properties contribute to viral assembly and entry. By combining biochemical, cellular, structural, and proteomic approaches, the work advances our molecular understanding of coronavirus biology and highlights potential targets for antiviral intervention.
- català
