Papel de la astrosenescencia en el envejecimiento del hipocampo y estudio del efecto anti-senescente de compuestos con interés senolítico

• Autores: Stefano Giannello Ercoli Ortiz
• Directores de la Tesis: Helena Mira Aparicio (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2025
• Idioma: español
• Número de páginas: 223
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ander Matheu (presid.), Mireia Moreno Estellés (secret.), Fernando de la Cuesta Marina (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
• Calificación: Sobresaliente Cum Laude
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RODERIC
• Resumen

  • El envejecimiento es un proceso biológico complejo y multifactorial que se caracteriza por la acumulación progresiva de daño celular, lo que conduce a una disminución en la funcionalidad de los tejidos y órganos. Dentro de este contexto, un fenómeno clave asociado al envejecimiento es la senescencia celular, definida como un estado de detención irreversible en la progresión del ciclo celular, que puede ser inducido por diversos tipos de factores y que está asociado con una alteración en la expresión génica y la funcionalidad biológica. Los astrocitos, células clave del sistema nervioso central, también pueden entrar en un estado de senescencia, un fenómeno conocido como astrosenescencia, que posiblemente está relacionado con la disfunción neuronal y el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. La astrosenescencia no solo afectaría a la capacidad de los astrocitos en cuanto a su actividad biológica, sino que también alteraría la comunicación celular mediada por factores secretados al medio condicionado de astrocitos (ACM). En relación a la senescencia, se han diseñado diferentes estrategias terapéuticas en base a moléculas naturales o sintéticas, con el objetivo de lograr eliminar las células senescentes en los tejidos de forma selectiva, concepto que define a estos compuestos como senolíticos. Los tratamientos con fármacos senolíticos en modelos animales de envejecimiento permiten mitigar los efectos negativos asociados a la acumulación de las células senescentes en los tejidos. Para investigar y caracterizar la astrosenescencia, en este trabajo utilizamos los modelos murinos SAMR1 y SAMP8. Por una parte, los ratones SAMR1 representan un modelo de envejecimiento normal, y por otra los ratones SAMP8 son un modelo de senescencia acelerada patológica caracterizado por la aparición temprana de deterioro cognitivo, neurodegeneración, neuroinflamación y otras características relacionadas con la edad. El estudio de la astrosenescencia que realizamos se puede dividir en dos grandes bloques: estudios in vivo, realizados a nivel de hipocampo en los cerebros de los modelos SAMR1 y SAMP8 a las edades de 2, 6 y 10 meses (2m, 6m y 10m); y estudios in vitro mediante la caracterización de dos metodologías de obtención de astrocitos en cultivo celular, en donde además evaluamos ensayos de viabilidad celular de tres compuestos con interés senolítico. Para los estudios in vivo, analizamos la reacción de SA-ß-gal para tres edades de interés y luego se identificaron los astrocitos y se determinó la disminución de los niveles de Lamin B1 y la morfología nuclear en varias regiones del hipocampo a 2m y 10m. Observamos que, analizando cualquier edad, en la mayoría de los estratos del hipocampo la cepa SAMP8 presenta diferencias significativas de mayor intensidad de SA-ß-gal en comparación con la cepa control SAMR1. Luego para el marcador Lamin B1 en astrocitos GFAP+ observamos que, independiente de la cepa de ratón, los astrocitos hipocampales GFAP+ en todos los estratos muestran una importante bajada en los niveles de Lamin B1 de 2m a 10m. En el segundo gran bloque de resultados, empleamos dos estrategias de cultivo celular para el estudio de la astrosenescencia. La primera de ellas a través de la obtención de Astrocitos Diferenciados (Ast-Dif) derivados de células madre neurales obtenidas de hipocampo de ratones SAMR1 y SAMP8, y en segunda instancia realizamos una estrategia de cultivo primario en medio definido partiendo de astrocitos aislados mediante el marcador de superficie astroglial ACSA-2 de hipocampo de ratones SAMR1 y SAMP8 a 2m, 6m y 10m. Los Ast-Dif del modelo SAMP8 mostraron marcas de senescencia, como mayores niveles de células SA-ß-gal+, una disminución significativa en la expresión de Lamin B1 y un incremento en los niveles de p16INK4a y en la expresión génica de p21CIP1. Por otra parte, los Astrocitos de cultivo primario ACSA-2 de SAMP8 mostraron mayores niveles de células SA-ß-gal+ en todas las edades de estudio, a 6m una disminución significativa en la expresión génica de Lmnb1 y un incremento en la expresión génica de Il1ß. A diferencia del ACM derivado de Ast-Dif y astrocitos ACSA-2 de SAMR1, el ACM de SAMP8 no presentó capacidad sinaptogénica en todas las edades de estudio, y el ACM de los cultivos a 6m tuvo un nulo impacto en la neuritogénesis, analizado en neuronas hipocampales de cultivo primario. La pérdida de capacidad sinaptogénica se relacionó con una reducción en la expresión de trombospondina-1 (TSP-1). Luego desarrollamos un modelo de obtención de astrocitos senescentes por daño al ADN con doxorrubicina (Doxo) y evaluamos su efectividad mediante los marcadores de senescencia gammaH2AX, 53BP1, SA-ß-gal y Lamin B1 en Ast-Dif SAMR1 y SAMP8. Observamos que cuando se tratan las células de ambas cepas con concentraciones elevadas de Doxo, se consigue un notable y significativo aumento en el porcentaje de células positivas para las marcas gammaH2AX, 53BP1 y SA-ß-gal y un decrecimiento en los niveles nucleares de Lamin B1, tanto en los Ast-Dif SAMR1 y SAMP8, en comparación con el vehículo. A concentraciones más bajas, los Ast-Dif SAMP8 fueron más sensibles al daño inducido por la Doxo en comparación con los Ast-Dif SAMR1. Finalmente nos planteamos indagar en el efecto senolítico y muerte de las células senescentes a través del uso de diferentes moléculas descritas en literatura como: Fisetina, Quercetina y Dasatinib, mediante ensayos de viabilidad celular en los Ast-Dif SAMR1 y SAMP8 tratados con la Doxo o con vehículo. Los astrocitos tratados con vehículo presentaron valores de IC50 más elevados que los tratados con Doxo, lo que sugiere que los 3 compuestos presentan un mayor efecto citotóxico en los astrocitos con senescencia inducida por daño al ADN. Además, se determinó que las células más sensibles a los compuestos senolíticos fueron los Ast-Dif SAMP8 tratados con Doxo y se exploró el uso de Quercetina y Dasatinib in vivo. En conjunto los resultados obtenidos en este trabajo resaltan la contribución de la astrosenescencia a la disfunción del microambiente neuronal en el envejecimiento, y en particular, desvelan un posible papel en la reducción de las sinapsis en el hipocampo. La mayor actividad de SA-ß-gal, la disminución de Lamin B1 y el aumento de p16INK4a y p21CIP1 en Ast-Dif SAMP8 sugieren un fenotipo senescente, planteando un nuevo modelo de estudio para la astrosenescencia in vitro, que recapitula la alteración de las funciones sinaptogénicas y neuritogénicas observadas en los cultivos primarios. También refuerzan el uso de compuestos senolíticos como Fisetina, Quercetina y Dasatinib, que ofrecen una estrategia terapéutica prometedora para mitigar las consecuencias de la senescencia celular. La mayor susceptibilidad de los astrocitos senescentes a estos compuestos sugiere que podrían ser utilizados para eliminarlos de manera selectiva y tratar de restaurar, al menos parcialmente, la funcionalidad neuronal en el hipocampo y posiblemente en otras regiones del cerebro envejecido.