Reprogramación lipidómica en la adquisición de resistencia al tratamiento anti-EGFR asociada al fenotipo mesenquimal en cáncer pulmonar
- Autores: Adrián López Chamorro
- Directores de la Tesis: Agustín Lahoz Rodríguez (dir. tes.), Julián Carretero Asunción (tut. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2025
- Idioma: español
- Número de páginas: 240
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alfonso Calvo González (presid.), Marta Isabel Roca Marugán (secret.), Víctor Javier Sánchez-Arévalo Lobo (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Fisiología por la Universitat de València (Estudi General)
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
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- Resumen
El cáncer de pulmón (CP) es la neoplasia con mayor mortalidad en el mundo occidental, siendo el carcinoma pulmonar no microcítico (CPNM) el subtipo más frecuente con más del 80% de los casos registrados. En estos casos, la supervivencia a los 5 años no supera el 15%, esto es debido fundamentalmente al diagnóstico tardío del CPNM, a la falta de respuesta a las terapias existentes y/o a la aparición de resistencias al tratamiento. El diseño de terapias dirigidas contra el receptor para el factor de crecimiento epitelial (EGFR), como los inhibidores tirosina-quinasa (ITQs) gefitinib, erlotinib y osimertinib, han supuesto un gran beneficio clínico para pacientes con CPNM dirigido por mutaciones en EGFR mejorando notablemente las ratios de supervivencia. Por ello, actualmente, son el tratamiento de elección en primera línea en este tipo de pacientes. Sin embargo, a pesar de que en un 70% de los casos hay respuesta inicial, la gran mayoría acaban progresando debido al desarrollo de resistencias por múltiples mecanismos, entre ellos la activación de la transición epitelial-mesenquimal (EMT). La EMT constituye un programa biológico de transdiferenciación en el que células epiteliales polarizadas experimentan múltiples cambios moleculares y morfológicos que les acaban confierendo un fenotipo mesenquimal. Este proceso está orquestado por un complejo programa transcripcional regulado por un conjunto de factores de transcripción (EMT-FTs) que se activan secuencialmente de manera dependiente del contexto celular y caracterizado por la represión de marcadores epiteliales como E-cadherina (CDH1) y la sobreexpresión de marcadores mesenquimales como N-cadherina (CDH2) y Vimentina (VIM). En el contexto del cáncer, la EMT se ha asociado a la progresión tumoral, la diseminación metastásica y la aparición de resistencias a fármacos como los ITQs. Como en otros procesos de diferenciación celular, la EMT implica una reprogramación metabólica de las células tumorales, favoreciendo su adaptación dinámica al microambiente tumoral (MAT). A pesar de la importancia de los lípidos como componentes fundamentales de las membranas celulares, fuente de energía y su papel en distintos procesos de señalización celular, los cambios lipidómicos asociados a la EMT han sido poco estudiados. Por ello, el objetivo principal de la presente tesis doctoral es profundizar en el conocimiento de la reprogramación lipidómica que acompaña a la EMT durante la adquisición de resistencia al tratamiento con ITQs del CPNM con mutaciones en EGFR. Con ello, se pretende identificar alteraciones metabólicas que puedan constituir dianas terapéuticas que permitan revertir o retrasar la EMT y, por tanto, restaurar la sensibilidad a los ITQs. Para ello se utilizaron líneas celulares de CPNM con mutaciones en EGFR clínicamente relevantes sensibles al ITQ de 3ª generación osimertinib de las que se obtuvieron sus correspondientes líneas resistentes. En estos modelos la adquisición de resistencia se asoció inequívocamente a la activación del programa EMT, con una fuerte represión de marcadores epiteliales y un aumento de marcadores mesenquimales acompañado de un aumento en la capacidad de migración e invasión. El análisis transcriptómico y lipidómico de estos modelos celulares reveló importantes cambios tanto a nivel de expresión de genes relacionados con la homeostasis lipídica como en la composición del lipidoma celular. Un importante número de estos cambios son dependientes del modelo de resistencia utilizado, algo esperarable dado el distinto origen y genotipo de las líneas celulares utilizadas. Aún así se identificaron cambios comunes en todos los modelos utilizados lo que sugiere la existencia de mecanismos compartidos susceptibles de ser intervenidos farmacológicamente. El análisis transcriptómico, mediante RNA-seq, permitió identificar una firma de resistencia (Firma O-R) capaz de discriminar entre los fenotipos sensible/resistente y en la que están representadas de forma significativa familias de genes involucradas en el proceso de EMT, así como genes involucrados en el metabolismo lipídico. Por otro lado, el análisis lipidómico mediante HPLC-MS, permitió identificar un total de 35 lípidos con una diferencia significativa en su abundancia entre líneas sensibles y resistentes. Las clases de lípidos que mostraron los cambios más significativos fueron los fosfolípidos plasmalógenos (PCp, PEp, PCo y PEo), que disminuyeron en las líneas resistentes, mientras que los lípidos neutros, como los triglicéridos y los ésteres de colesterol aumentaron. Además, se observó una preferencia de las líneas resistentes por fosfolípidos con cadenas de ácidos grasos de longitudes intermedias (C36-C38) y con una tendencia hacia la insaturación (1 o más dobles enlaces). Por su parte, las líneas sensibles presentan una preferencia por fosfolípidos con cadenas más largas (C40-C42) y con una tendencia hacia la saturación. El análisis de los ácidos grasos totales mostró, tras su liberación de los lípidos complejos, tendencias comunes para todos los modelos. Los ácidos grasos 16:1n9, 18:3n6 y 20:6n3 presentaron niveles superiores en las líneas resistentes en comparación con las sensibles. Por el contrario, los ácidos grasos saturados (SFA) de cadena larga 20:0, 22:0, 24:0 y 26:0 presentan una tendencia contraria y disminuyen significativamente en las líneas resistentes. Además, se observaron diferencias en el balance entre SFA, monoinsaturados (MUFA) y poliinsaturados (PUFAs) en las líneas resistentes en comparación con los modelos sensibles. La integración de datos de expresión génica y de lipidómica evidenció conexiones entre cambios en expresión de genes y lípidos asociados a la EMT. Los genes DGAT2, SCD5 y FADS3 destacaron por sobreexpresarse en las líneas resistentes mientras que otros genes como FOXA1, CDS1 y GPD2 mostraron una profunda represión. De entre estas potenciales dianas se seleccionó FADS3 para su posterior estudio debido a: i) su sobreexpresión en todos los modelos de CPNM resistentes a osimertinib; ii) su conexión con la EMT; iii) la oportunidad de descubrir nuevas funciones de esta enzima; y iv) el potencial desarrollo de nuevas terapias basadas en su inhibición. Para confirmar el papel de FADS3 en la EMT se llevó a cabo su validación funcional. La sobreexpresión de FADS3 en los modelos de CPNM resistentes a osimertinib por activación de la EMT, se confirmó mediante RT-qPCR y Western blot. La expresión de FADS3 aumentó tras la exposición aguda a osimertinib en los modelos sensibles, sugiriendo un papel en la adaptación inicial al fármaco y en las etapas iniciales de la EMT. Por otro lado, también se observó aumento en los niveles de FADS3 tras su exposición a TGF-ß, un inductor canónico de la EMT, lo que sugiere una relación directa entre FADS3 y la EMT. La sobreexpresión ectópica de FADS3 en la línea celular sensible 1975 indujó la sobreexpresión de marcadores de EMT y pluripotencia, junto con una mayor capacidad migratoria y un aumento en la resistencia a osimertinib. A nivel metabólico, la sobreexpresión de FADS3 modificó el perfil lipidómico general. Se observó un aumento en los productos de su reacción (i.e., Cer(d18:2/x)) y sus metabolitos asociados (i.e., SM(d18:2/x)), así como una reducción en la síntesis de ácidos grasos y una mayor captación de éstos del medio extracelular. Además, su sobreexpresión determinó cambios en vías de señalización relacionadas con EGFR, lo que sugiere una interacción con mecanismos clave en la resistencia a ITQs. Por el contrario, el silenciamiento de FADS3 en la línea 1975 AZDR revirtió parcialmente estos efectos, reafirmando su papel en la resistencia a osimertinib y en la transición EMT. Estos hallazgos subrayan el potencial de FADS3 como diana terapéutica para retrasar o revertir la EMT y refuerzan la importancia del metabolismo lipídico en la plasticidad tumoral y la resistencia a fármacos. Por último, se realizó un análisis lipidómico de sueros de pacientes con CPNM portadores de mutaciones en EGFR (n=65). En una etapa inicial, se identificaron asociaciones significativas entre los niveles de ciertas especies lipídicas antes del tratamiento y dos importantes variables clínicas como son la progresión libre de enfermedad (PFS) y la supervivencia global (OS). Los lípidos que se asociaron con un menor riesgo de exitus, así como de progresión de enfermedad corresponden a especies de lisofosfolípidos: LPC(18:1), LPI(18:1), LPE(20:1) y LPC(18:3). Por otro lado, también se encontraron lípidos cuyos niveles están asociados a un mayor riesgo de exitus, así como de progresión. Estos lípidos corresponden a especies de ceramidas y ácidos grasos: Cer(d18:0/24:1), FA(18:2) y FA(22:2). Esta firma lipidómica podría convertirse en una herramienta útil para predecir qué pacientes van a responder mejor o peor a los ITQs. En una segunda etapa, se analizaron muestras de suero en el momento de la progresión de la enfermedad, lo que permitió identificar alteraciones de lípidos asociadas a este evento. Cabe destacar que las alteraciones de determinados LPC y LPEs observadas a nivel basal se mantuvieron en el momento de la progresión lo que refuerza el potencial de la firma lipidómica como biomarcador de prognosis y monitorización. Aunque resultan prometedores, estos resultados necesitan ser validados en una cohorte de pacientes mayor y en un estudio prospectivo. En resumen, esta tesis doctoral ha permitido profundizar en el conocimiento de la reprogramación lipidómica asociada a la aparición de resistencia a los ITQs mediante un mecanismo EMT en el tratamiento del CPNM-EGFR. Se han identificado alteraciones clave en la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico que dirigen una importante reprogramación lipidómica. En este contexto se propone, por primera vez, a FADS3 como un actor relevante en la adquisición de resistencia a ITQs mediante un mecanismo EMT. Además, se identifica una firma lipidómica en sueros de pacientes que podría predecir la progresión de la enfermedad y guiar futuras estrategias terapéuticas. Estos hallazgos subrayan la importancia del metabolismo de lípidos en la resistencia a fármacos y abren nuevas vías para el desarrollo de terapias dirigidas a retrasar o revertir la EMT y de este modo, potenciar o restaurar la sensibilidad a los ITQs en el tratamiento del CPNM-EGFR.
