Nuevas estrategias biotecnológicas para la biodegradación de plásticos convencionales: Consorcios microbianos
- Autores: Jesús Salinas Nieto
- Directores de la Tesis: María José López López (dir. tes.), Francisca Suárez Estrella (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Almería ( España ) en 2025
- Idioma: español
- Número de páginas: 183
- Títulos paralelos:
- New biotechnological strategies for the biodegradation of conventional plastics: Microbial consortia
- Tribunal Calificador de la Tesis: Raúl Moral Herrero (presid.), Macarena del Mar Jurado (secret.), Patrizia Cinelli (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología y Bioprocesos Industriales Aplicados a la Agroalimentación y Medioambiente por la Universidad de Almería
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
- español
Desde mediados del siglo XX, la producción masiva de plásticos ha generado una crisis ambiental debido a su acumulación en vertederos y ecosistemas naturales. Así, se estima que, de los 8.300 millones de toneladas de plásticos producidos globalmente, aproximadamente el 79% permanece sin gestionarse adecuadamente, y menos del 10% es reciclado de manera efectiva. Esta problemática resalta la necesidad de disponer de alternativas sostenibles para la gestión de plásticos, entre las que los sistemas biológicos ocupan un lugar destacado. Ciertos microorganismos, gracias a enzimas tales como lipasas, cutinasas y ligninasas, han demostrado la capacidad de degradar plásticos convencionales muy recalcitrantes tales como el polietileno. Sin embargo, la eficiencia degradativa está limitada, entre otras cosas, por el restringido espectro enzimático que resulta insuficiente para abordar la complejidad que requiere la degradación de los plásticos. En este contexto, el empleo de consorcios microbianos constituidos por dos o más microorganismos se presenta como una solución innovadora, debido a que la combinación de actividades complementarias, incluyendo un mayor rango de enzimas o una mejorada capacidad colonizadora, permiten abordar la complejidad y diversidad estructural de los plásticos. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue la bioprospección de microorganismos degradadores de plásticos a partir de diversos entornos ambientales para construir consorcios con alta eficacia degradativa en un amplio espectro de polímeros plásticos. Para la consecución de este objetivo principal, se desarrollaron dos estrategias que permitieron obtener microorganismos degradadores de plásticos, tal y como se recoge en los Capítulos 1 y 2 (Sección VII) de esta memoria de Tesis, que se ensamblaron en diversos consorcios cuya eficacia degradativa fue validada en la última fase experimental expuesta en el Capítulo 3 (Sección VII). Una de las estrategias, basada en un proceso de evolución dirigida, implicó un enriquecimiento selectivo a partir de una muestra de suelo contaminado con plástico como única fuente de carbono Para ello, se utilizó un microcosmos contaminado, consistente en una muestra de suelo agrícola en la que se enterró polietileno lineal de baja densidad (LLDPE), buscando promover una exposición prolongada de los microorganismos del suelo al plástico y ejercer una presión selectiva. A partir de estas muestras se realizaron cultivos de enriquecimiento en medio mínimo con film o polvo (microplástico) de LLDPE como única fuente de carbono. Se realizó un enriquecimiento secuencial efectuando transferencias mensuales a medio de cultivo fresco durante un total de 105 días de incubación, monitoreando la abundancia de bacterias y hongos totales en cada transferencia. Dado que la lignina comparte similitudes de recalcitrancia con el LLDPE, también se evaluó la abundancia de microorganismos ligninolíticos bajo la hipótesis de que podrían desempeñar un papel relevante en la degradación de plásticos convencionales. Este enfoque permitió seleccionar dos consorcios microbianos naturales estables. Los microorganismos de ambos consorcios fueron aislados, identificados molecularmente y se caracterizó su perfil enzimático relacionado con la biodegradación del plástico. El análisis mostró que, a medida que avanzaba el proceso de enriquecimiento, se producía una disminución en la diversidad microbiana. El consorcio seleccionado en LLDPE-polvo fue más efectivo que el correspondiente a cultivos con LLDPE-film, logrando una reducción en el peso de los microplásticos entre 2,5% y 5,5%. Algunos miembros de los consorcios mostraron una amplia gama de actividades enzimáticas relacionadas con la degradación de polímeros plásticos recalcitrantes, destacando las cepas Pseudomonas aeruginosa REBP5 y Pseudomonas alloputida REBP7. Las cepas identificadas como Castellaniella denitrificans REBF6 y Debaryomyces hansenii RELF8 también fueron consideradas relevantes, aunque presentaron un menor espectro enzimático. Otros miembros del consorcio podrían colaborar en la degradación preliminar de aditivos asociados al polímero LLDPE, facilitando el acceso posterior a degradadores más eficientes de la estructura de plástico. Estos resultados se recogen en el Capítulo 1 de esta Memoria. Una segunda estrategia para la obtención de microorganismos degradadores de plásticos, que se aborda en el Capítulo 2, se basó en la bioprospección de microorganismos ligninolíticos asociados al compostaje de residuos vegetales. Este estudio tuvo como objetivo demostrar la idoneidad del compostaje como fuente ideal de microorganismos degradadores de plásticos, así como que el criterio de selección basado en el rastreo de cepas ligninolíticas podía conducir a la obtención de cepas con elevado potencial. Estos aspectos se demostraron diseñando consorcios microbianos artificiales con las cepas seleccionadas cuya eficiencia degradativa se comparó con la de los cultivos puros, así como su versatilidad para la degradación de diversos plásticos. Para ello, se estudió el microbioma del compost el cual mostró funcionalidad degradadora de plásticos, especialmente en el material vegetal de partida y en la fase de enfriamiento. Entre los aislados a partir del material sometido a compostaje se seleccionaron los hongos y bacterias ligninolíticos y se analizó su capacidad para producir enzimas asociadas a la degradación de plásticos, así como para colonizar películas plásticas. Los géneros Bacillus, Pseudomonas, Fusarium, Aspergillus, Scedosporium y Pseudallescheria exhibieron una amplia gama de actividades relacionadas con la biodegradación de plásticos, lo que los convierte en candidatos para el ensamblaje de consorcios. La biodegradación de polietileno mediante cultivos individuales y en consorcio reveló que los consorcios, en particular aquellos que combinan Bacillus subtilis RBM2 con Fusarium oxysporum RHM1, incrementaron la eficiencia de degradación. Las combinaciones bacterianas, como Pseudomonas aeruginosa RBM21 y Bacillus subtilis RBM2, demostraron una capacidad degradativa de amplio espectro, siendo activos frente a varios polímeros. Estos resultados permitieron demostrar la efectividad tanto del tipo de muestra como de la estrategia propuesta para la obtención de candidatos adecuados para su integración en consorcios degradadores de plásticos. En la última fase experimental, que se aborda en el Capítulo 3, se emplearon cepas fúngicas y bacterianas seleccionadas en los estudios anteriormente descritos para ensamblar consorcios y validar su capacidad para degradar diversos plásticos, incluyendo polietileno de baja densidad (LDPE), el LLDPE, el PET y el poliestireno (PS), y establecer la existencia de diferencias degradativas dependiendo de si dichos plásticos eran vírgenes o reciclados. Para ello, se ensamblaron consorcios según su complementariedad enzimática combinando cepas bacterianas y fúngicas, cuya capacidad para degradar tanto plásticos vírgenes como reciclados se evaluó mediante técnicas gravimétricas y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Los consorcios C2 (formado por Bacillus subtilis RBM2, Fusarium oxysporum RHM1 y Alternaria alternata RHM4) y C4 (Bacillus subtilis RBM2 y Pseudomonas alloputida REBP7) mostraron los mejores resultados, logrando una reducción significativa en el peso de plásticos como LDPE reciclado, LLDPE virgen y PET reciclado. El análisis FTIR confirmó estos hallazgos, evidenciando cambios en la estructura química y los grupos funcionales de los plásticos tratados, lo que reflejó una interacción directa entre los consorcios y el material plástico, facilitando su degradación. De acuerdo con los resultados obtenidos, el uso de estrategias biológicas basadas en el diseño y empleo de consorcios microbianos representa un enfoque prometedor para abordar la problemática de los plásticos convencionales
- English
Since the mid-20th century, the mass production of plastics has generated an environmental crisis due to its accumulation in landfills and natural ecosystems. It is estimated that of the 8.3 billion tonnes of plastics produced globally, approximately 79% remains unmanaged, while less than 10% is effectively recycled. This issue highlights the urgent need for sustainable alternatives to plastic management, among which biological systems hold significant promise. Certain microorganisms, through enzymes such as lipases, cutinases, and ligninases, have demonstrated the ability to degrade highly recalcitrant conventional plastics such as polyethylene. However, the degradative efficiency is limited by factors such as the restricted enzymatic spectrum, which is insufficient to address the complexity required for plastic degradation. In this context, microbial consortia composed of two or more microorganisms emerge as an innovative solution. By combining complementary activities, including a broader range of enzymes and enhanced colonization capabilities, microbial consortia can better tackle the structural complexity and diversity of plastics.
The main objective of this Doctoral Thesis was the bioprospecting of plastic-degrading microorganisms from diverse environmental settings to construct consortia with high degradative efficiency across a wide range of plastic polymers. To achieve this overarching goal, two strategies were developed to isolate plastic-degrading microorganisms, as detailed in Chapters 1 and 2 (Section VII) of this Thesis. These microorganisms were subsequently assembled into various consortia, whose degradative efficacy was validated during the final experimental phase presented in Chapter 3 (Section VII).
One of the strategies involved selective enrichment from a contaminated soil sample through directed evolution in a medium containing plastic as the sole carbon source. For this purpose, a contaminated microcosm was established, consisting of an agricultural soil sample in which low-density linear polyethylene (LLDPE) was buried to promote prolonged exposure of soil microorganisms to plastic and to exert selective pressure. Enrichment cultures were subsequently performed using a minimal medium supplemented with either LLDPE film or powder (microplastic) as the sole carbon source. Sequential enrichment was carried out with monthly transfers to fresh culture medium over a total incubation period of 105 days, monitoring the total abundance of bacteria and fungi during each transfer. Given that lignin shares similarities in recalcitrance with LLDPE, the abundance of ligninolytic microorganisms was also evaluated under the hypothesis that these microorganisms might play a significant role in the degradation of conventional plastics. This approach resulted in the selection of two stable natural microbial consortia. The components of both consortia were isolated, molecularly identified, and characterised for their enzymatic profiles related to plastic biodegradation. Analysis revealed that as the enrichment progressed, microbial diversity decreased. The consortium enriched on LLDPE powder was more effective than the one obtained with LLDPE film, achieving a microplastic weight reduction between 2.5% and 5.5%. Some members of the consortia exhibited a broad range of enzymatic activities associated with the degradation of recalcitrant plastic polymers, notably the strains Pseudomonas aeruginosa REBP5 and Pseudomonas alloputida REBP7. The strains identified as Castellaniella denitrificans REBF6 and Debaryomyces hansenii RELF8 were also relevant, although they exhibited a narrower enzymatic spectrum. Other consortium members may contribute to the preliminary degradation of additives of the LLDPE polymer, facilitating subsequent access of more efficient degraders to the plastic structure. These findings are presented in Chapter 1 of this Thesis.
A second strategy for obtaining plastic-degrading microorganisms, developed in Chapter 2, was based on the bioprospecting of ligninolytic microorganisms associated with plant waste composting. This study aimed to demonstrate the suitability of composting as an ideal source of plastic-degrading microorganisms, besides the effectiveness of a selection criterion based on screening for ligninolytic strains. These aspects were addressed by designing artificial microbial consortia with the selected strains, whose degradative efficiency was compared with that of pure cultures, and by evaluating their versatility in degrading various plastics. To this end, the compost microbiome was studied, revealing plastic-degrading functionality, particularly in the starting plant material and during the cooling phase. Among the isolates obtained from the compost material, ligninolytic fungi and bacteria were selected and analzed for their ability to produce enzymes associated with plastic degradation and to colonise plastic films. The genera Bacillus, Pseudomonas, Fusarium, Aspergillus, Scedosporium, and Pseudallescheria exhibited a wide range of activities related to plastic biodegradation, making them promising candidates for assembling consortia. The biodegradation of polyethylene through individual cultures and consortia revealed that consortia, particularly those combining Bacillus subtilis RBM2 with Fusarium oxysporum RHM1, enhanced degradation efficiency. Bacterial combinations, such as Pseudomonas aeruginosa RBM21 and Bacillus subtilis RBM2, demonstrated broad-spectrum degradative capabilities, being active against various polymers. These results demonstrated the effectiveness of both the sample type and the proposed strategy in identifying suitable candidates for integration into plastic-degrading consortia.
In the final experimental phase, addressed in Chapter 3, selected fungal and bacterial strains from the previously described studies were used to assemble consortia and validate their capacity to degrade various plastics, including low-density polyethylene (LDPE), linear low-density polyethylene (LLDPE), polyethylene terephthalate (PET), and polystyrene (PS). The study also aimed to establish degradative differences depending on whether the plastics were virgin or recycled. Consortia were assembled based on enzymatic complementarity, combining bacterial and fungal strains. Their ability to degrade virgin and recycled plastics was evaluated using gravimetric techniques and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR). The consortia C2 (comprising Bacillus subtilis RBM2, Fusarium oxysporum RHM1, and Alternaria alternata RHM4) and C4 (Bacillus subtilis RBM2 and Pseudomonas alloputida REBP7) showed the best results, achieving significant weight reductions in plastics such as recycled LDPE, virgin LLDPE, and recycled PET. FTIR analysis confirmed these findings, revealing changes in the chemical structure and functional groups of the biodegraded plastics, indicating a direct interaction between the consortia and the plastic material, thereby facilitating its degradation.
According to the results obtained, the biological strategies based on the design and application of microbial consortia represent a promising approach to addressing the challenges posed by conventional plastics.
- español
