Explotando la regulación local epigenética en el diseño de estrategias de terapia génica mediada por integración dirigida en células madre hematopoyéticas

• Autores: Iris Ramos Hernández
• Directores de la Tesis: Francisco Martín Molina (codir. tes.), Francisco Javier Molina Estévez (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2025
• Idioma: español
• ISBN: 9791370150341
• Número de páginas: 246
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  • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
• Resumen

  • Las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs, del inglés Hematopoietic Stem and Progenitor Cells) presentan la capacidad de autorrenovarse y de diferenciarse en todos los tipos celulares sanguíneos e inmunológicos desde su nicho en la médula ósea. Es por ello, que las HSPCs presentan un enorme potencial terapéutico que ha sido aplicado desde 1960 para el tratamiento de distintas patologías mediante el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT, del inglés Hematopoietic Stem Cell Transplantation) alogénico. Entre las patologías con potencial tratamiento tras el HSCT, cabe destacar su empleo en enfermedades monogénicas que afectan al sistema hematológico, así como trastornos metabólicos hereditarios. En el primero de los casos, las HSPCs sanas son capaces de restaurar la función hematopoyética y/o inmunológica, mientras que en el segundo de los casos el HSCT puede compensar parcialmente los defectos genéticos, proporcionando las proteínas necesarias de manera paracrina mediante corrección cruzada. Sin embargo, el HSCT alogénico presenta ciertos desafíos en su aplicación clínica, como la disponibilidad de donantes compatibles limitada, el riesgo de rechazo y de desarrollar la enfermedad injerto contra huésped (EICH). Una reciente posible solución que se ha desarrollado para esta problemática es el HSCT autólogo de las propias HSPCs del paciente previamente modificadas genéticamente ex vivo, que permite restaurar un fenotipo sano en el paciente. De hecho, esta estrategia ha permitido el desarrollo de varios tratamientos aprobados por el FDA (Del inglés Food and Drug Administration) y la EMA (del inglés European Medicines Agency) para el tratamientos de distintas patologías hematológicas y no hematológicas. No obstante, a pesar del incuestionable avance de la terapia génica aplicada a la modificación de las HSPCs ex vivo, estas estrategias no quedan exentas de riesgos. En particular, su aplicación para conseguir una corrección cruzada vía paracrina con el objetivo de entregar las proteínas terapéuticas a células no hematopoyéticas presenta desafíos. Esto es debido a que la expresión elevada del transgén requerida puede ser perjudicial en los estadios más multipotentes de las HSPCs, que, además, componen las poblaciones que muestran peores eficacias de edición genómica. Con el propósito de optimizar la terapia génica en HSPCs ex vivo, en esta tesis doctoral se ha desarrollado una nueva estrategia de edición vía knock-in (KI), a la que nos referiremos como KI-Ep (de la combinación de las palabras inglesas Knock-In y Epigenetically regulated). Dicha estrategia se planteó con el objetivo principal de regular la expresión del transgén integrado de manera sitio-específica, aprovechando la regulación epigenética natural de la diana elegida para el KI. Para ello partimos de la hipótesis inicial de que la integración de un ácido desoxirribonucleico (ADN) donador en un locus con marcas epigenéticas asociadas a bivalencia en HSPCs permitiría la extensión de la regulación epigenética sobre el promotor exógeno del donador integrado en dicho locus. En primer lugar, se seleccionó un locus diana idóneo para la integración del transgén de interés, considerando su estado epigenético y regulatorio en HSPCs y monocitos. Esta selección se basó en la búsqueda de genes mieloides que presentaran grandes diferencias de expresión entre los estadios indiferenciados de las HSPCs y los monocitos, seguido de una evaluación del perfil epigenético y regulatorio del locus, para verificar su carácter bivalente. Siguiendo estos criterios, se seleccionó el locus CX3CR1 para realizar la integración del transgén, ya que fue el que mostró la mayor diferencia de expresión de ácido ribonucleico (ARN) mensajero (ARNm) entre estadios indiferenciados y diferenciados. Esto, junto a la presencia de marcas epigenéticas activadoras y represoras asociadas a un estado bivalente, lo convertían un candidato ideal para evaluar la hipótesis planteada. Por otra parte, para evitar alterar la expresión fisiológica de CX3CR1, se decidió dirigir la integración del ADN donador al intrón de este locus (CX3CR1-I). Consecutivamente, se optimizó el proceso de KI en HSPCs mediante la evaluación de distintos donadores que incluían un promotor SFFV (del inglés Spleen Focus-Forming Virus promoter) dirigiendo la expresión de eGFP (del inglés Enhanced Green Fluorescent Protein) y una secuencia de poliadenilación (pA): SFFV-eGFP-pA. Estos donadores se diseñaron para aprovechar distintas vías de reparación de la rotura de la cadena doble de ADN (DSB, del inglés Double strand break) inducida por la nucleasa seleccionada. Una vez seleccionado el diseño más eficiente, se verificó que los análisis in vitro validaron la hipótesis planteada, demostrando que el KI-Ep permitía una baja expresión del transgén en los estadios más indiferenciados de las HSPCs, mientras que en los estadios más diferenciados la expresión del transgén se incrementaba, tanto en porcentaje como en intensidad. Fenómeno que no se reportó al evaluar la expresión de un transgén análogo (SFFV-eGFP) entregado a las HSPCs mediante vectores lentivirales (VLs), los cuales presentan un patrón de integración semialeatorio. Al analizar el comportamiento de estas HSPCs KI-Ep in vivo, se detectó una muy baja expresión del transgén reportero en las HSPCs KI-Ep más multipotentes o long-term HSPCs (LT-HSPCs) presentes en médula ósea, las cuales permiten la hematopoyesis a largo plazo. Asimismo, confirmando la hipótesis planteada, la población mieloide CD11b+ fue la que mostró los niveles e intensidad de expresión del transgén en todos los tejidos analizados. Estos datos reafirman la idoneidad de la estrategia KI-Ep en estrategias donde se requieran niveles de expresión bajos en LT-HSPCs y elevados en células mieloides. Finalmente, se demostró la adquisición de marcas epigenéticas asociadas a un estado bivalente en el promotor exógeno integrado, similares a las detectadas en el locus diana de la integración durante estadios indiferenciados de las HSPCs KI-Ep. Además, se identificó una correlación entre los cambios de expresión del transgén tras la diferenciación, y la transición de las marcas epigenéticas de bivalentes a activadoras. Asimismo, se descartó la modulación del transgén vía metilación de ADN en las muestras HSPCs KI-Ep y macrófagos derivados de estas in vitro, detectando incluso un efecto protector en el promotor SFFV frente al silenciamiento. En conclusión, esta tesis doctoral introduce el concepto KI-Ep, una estrategia que permite la modulación epigenética del transgén integrado de manera sitioespecífica durante las etapas progenitoras de las HSPCs, y su activación posterior tras la diferenciación o compromiso con un linaje.