Teleost erythrocytes as mediators of antiviral immunity: molecular and cellular responses triggered by vaccination strategies

• Autores: María Elizabhet Salvador Mira
• Directores de la Tesis: María del Mar Ortega-Villaizán Romo (dir. tes.), Luis Pérez García-Estañ (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2026
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ottavia Benedicenti (presid.), Paloma Alonso Magdalena (secret.), Byron Morales-Lange (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular y Celular por la Universidad Miguel Hernández de Elche
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• Resumen

  • Thesis summary: Viral outbreaks remain a major constraint for aquaculture, and vaccine efficacy is frequently limited by suboptimal antigen stability and reduced protective responses. Teleost red blood cells (RBCs) are nucleated and transcriptionally active and are increasingly acknowledged as integral components of the immune system that exhibit interferon signaling, cytokine modulation, and antigen-presenting cell-like (APC-like) properties, essential for pathogen recognition and clearance. Given their abundance, and systemic distribution, we hypothesized that fish RBCs can function as long–half-life cellular vehicles to enhance antigen delivery and immunomodulation, and that their antiviral signaling mechanisms can improve vaccine-induced immunity. Viral antigen stimulation, including UV-inactivated viral hemorrhagic septicemia virus (VHSVUV), a DNA vaccine based on a plasmid encoding the G-VHSV antigen (pmTFP1-GVHSV), and a nanostructured recombinant subunit vaccine based on the same antigen [referred to as nanopellet (NP)-GVHSV], induced an intracellular remodeling profile in RBCs characterized by endoplasmic reticulum (ER) expansion, increased vesicular biogenesis and mitochondrial reorganization. ER expansion was associated with increased ER folding demand during antigen processing, leading to ER stress and subsequent activation of the unfolded protein response (UPR). Notably, UPR-related genes were transcriptionally upregulated in RBCs, with predominant activation of the ATF6 branch in response to VHSVUV, pmTFP1-GVHSV, and NP-GVHSV. Furthermore, functional attenuation of ER stress increased VHSV replication, supporting that ER-UPR axis emerged as an antiviral effector program of RBCs. RBCs from VHSV-challenged or vaccine-immunized rainbow trout also showed upregulation of UPR-related genes accompanied by induction of autophagy–, mitochondrial stress–, vesicle trafficking–, antigen processing and presentation–related effectors. These mechanisms, triggered in RBCs by viral antigens, provide a rational evaluation of RBCs as relevant targets for delivery strategies. Accordingly, three lectin-like peptides were tested as fish RBC–binding ligands for new vaccine formulations. They showed high RBC affinity and internalization, and induced upregulation of interferon-stimulated genes. On the other hand, NP subunit vaccines against VHSV and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) functionalized with IFNγ as an adjuvant increased antigen uptake and induced antiviral and immunomodulatory transcriptional responses in RBCs. Remarkably, conjugation of an RBC ligand to IFNγ-functionalized NP vaccine further amplified RBC immune response, characterized by induction of interferon and cytokine signaling, galactoside binding, ER stress, and antigen presentation pathways, consistent with a predominantly cellular response profile. Collectively, these findings highlight the ER–UPR signaling as antiviral strategy of rainbow trout RBCs and supports the use of fish RBCs as immune delivery-competent cells to improve next-generation antiviral vaccine design in aquaculture.

    Resumen de la tesis: Las infecciones víricas suponen uno de los mayores obstáculos para la industria acuícola, y la eficacia de las vacunas a menudo se ve limitada por la escasa estabilidad de los antígenos y la disminución de las respuestas protectoras. En este sentido, los eritrocitos (RBCs) de teleósteos son nucleados y transcripcionalmente activos, y se reconocen cada vez más como componentes del sistema inmunitario. Intervienen en la señalización del interferón, modulan la respuesta a las citocinas y pueden adquirir características similares a las de las células presentadoras de antígenos (APC), que son esenciales para el reconocimiento y la eliminación de patógenos. Dada su abundancia y distribución sistémica, planteamos que los RBCs de peces pueden funcionar como vehículos celulares de larga vida media para mejorar la entrega de antígenos y ejercer efectos inmunomoduladores. Asimismo, la activación de los mecanismos antiviral de los RBCs puede potenciar la respuesta inducida por las vacunas. Para evaluar esta hipótesis, los RBCs de trucha arcoíris fueron estimulados con: el virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV) inactivado por UV (VHSVUV); una vacuna de ADN basada en un plásmido que codifica el antígeno G-VHSV (pmTFP1-GVHSV) y una vacuna de subunidad recombinante nanoestructurada basada en el mismo antígeno (denominada nanopellet o NP-GVHSV). En los tres casos se observó un remodelado intracelular caracterizado por una expansión del retículo endoplásmico (RE), un aumento de la biogénesis de vesículas y una reorganización mitocondrial. La expansión del RE fue coherente con una mayor demanda de plegamiento proteico durante el procesamiento antigénico, lo que desencadenó estrés del RE y la consiguiente activación de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). En particular, los genes asociados a la UPR se indujeron de manera significativa en los RBCs, con una activación predominante de la vía ATF6 en respuesta a VHSVUV, pmTFP1-GVHSV y NP-GVHSV. Además, la atenuación funcional del estrés del RE aumentó la replicación del VHSV, lo que sugiere que el eje RE-UPR actúa como un programa efector antiviral de los RBCs. Por otro lado, los RBCs de trucha arcoíris desafiadas con el VHSV o inmunizadas con pmTFP1-GVHSV y NP-GVHSV mostraron una regulación positiva de los genes relacionados con la UPR, acompañada de la inducción de efectores relacionados con la autofagia, el estrés mitocondrial, el tráfico de vesículas, el procesamiento y la presentación antigénica. Estos procesos inducidos por el procesamiento del antígeno vírico proporcionan una base sólida para considerar a los RBCs de peces como dianas relevantes en el desarrollo de nuevas estrategias de administración. En consecuencia, se evaluaron tres péptidos tipo lectina como ligandos de unión a RBCs para el diseño de nuevas formulaciones vacunales. Estos péptidos mostraron una alta afinidad y capacidad de internalización en los RBCs de trucha arcoíris, y una inducción de la expresión de genes estimulados por interferón. Paralelamente, las vacunas de subunidad contra el VHSV y el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), funcionalizadas con IFNγ como adyuvante, mejoraron la captación antigénica e indujeron respuestas transcripcionales antivirales e inmunomoduladoras en los RBCs. Finalmente, la conjugación de un ligando de RBCs en la vacuna funcionalizada con IFNγ amplificó aún más la respuesta inmunitaria de los RBCs, caracterizada por una activación de las rutas de interferón y citocinas, de unión a galactósidos, el estrés del RE y la presentación antigénica. En conjunto, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de la señalización RE-UPR como estrategia antiviral de los RBCs y respaldan su uso como células competentes para la distribución de inmunógenos con el fin de mejorar el diseño de vacunas antivirales de última generación más eficaces para la acuicultura.