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Enzimología de formas silvestres y mutantes de glutamina sintetasa eucariotas sobreexpresadas en escherichia coli

  • Autores: Marco Betti
  • Directores de la Tesis: Antonio José Márquez Cabeza (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2005
  • Idioma: español
  • Número de páginas: 211
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: Idus
  • Resumen
    • En este trabajo nos hemos propuestos abordar nuevos estudios de estructura-función de la GS eucariota (tipo II) haciendo uso de sistemas de expresión heteróloga que pudiesen permitir la obtención de grandes cantidades para isoformas citosólicas e plasticidad de esta enzima nos ha llevado a emprender un estudio comparado de la sobreexpresión en E. coli y de las propiedades de distintas formas de GS eucariotas tal y como se describe a continuación:

      1) GS citosólica ? de Phaseolus vulgaris Como se mencionó anteriormente, esta isoforma de GS se había estudiado previamente en nuestro laboratorio, abordándose trabajos con la proteína silvestre y con mutantes dirigidos, utilizando para ello un sistema de expresión que posibilitara la obtención de preparaciones de enzima parcialmente purificada. En este trabajo nos hemos propuesto ahora sobreexpresar y purificar a homogeneidad grandes cantidades de esta enzima para emprender nuevos estudios de estructura-función tales como la unión de los ligandos a la enzima mediante calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y determinación de la estructural cuaternaria y, en lo posible, su estructura tridimensional.

      2) GS citosólica de Tuber borchii Dado que habíamos estudiados una enzima citosólica de plantas, se nos ofreció una interesante colaboración con el grupo del Profesor Simone Ottonello (Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Universidad de Parma), que esta estudiando el metabolismo del nitrógeno de este hongo, y nos posibilita caracterizar una isoforma citosólica de un grupo bien diferenciado de organismos eucariotas no fotosintéticos. Resultado de este trabajo en colaboración ha sido la determinación de los parámetros catalíticos y estructura cuaternaria de la enzima, datos que resultaron importantes para determinar el papel fisiológico de la GS en la asimilación del amonio en Tuber.

      3) GS plastídica silvestre de Lotus japonicus En nuestro laboratorio se está estudiando el metabolismo del nitrógeno en esta leguminosa modelo. Por este motivo así como para poder comparar una isoforma de GS plastídica con las dos isoformas citosólicas mencionadas arriba, nos propusimos estudiar la GS plastídica de Lotus. Para ellos fue preciso obtener el cDNA completo del gen Gln2, clonarlo, sobreexpresarlo en Escherichia coli y purificar a homogeneidad la enzima recombinante para determinar sus parámetros catalíticos y su estructura cuaternaria.

      4) GS plastídica de mutantes fotorrespiratorios de Lotus japonicus El último objetivo de esta Tesis fue la caracterización a nivel molecular de los dos mutantes fotorrespiratorios de Lotus japonicus anteriormente descritos que se habían obtenido en nuestro laboratorio. Para ello se efectuó el estudio comparado de las plantas silvestres y mutantes a nivel de mRNA, proteína, actividad enzimática y secuencia del gen Gln2. Tal y como se mostrará posteriormente este estudió llevó a la producción de GS plastídicas mutantes sobreexpresándolas en E. coli, comparándose sus características con la correspondiente enzima plastídica silvestre de Lotus.


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