Resumen de Estudio de la oxidación de proteínas en ratas con encefalopatía hepática: una aproximación proteómica
María del Pilar Carbonero Aguilar
En esta Tesis se ha estudiado el efecto del estrés oxidativo inducido por un estado de hiperamonemia, utilizando como modelo animal ratas con derivación porto-cava (ratas-dpc). El objetivo principal ha sido ver como se afecta la expresión de proteínas en el cerebro de ratas-dpc y cual es la correlación existente entre estas posibles alteraciones y la sintomatología y/o base de la Encefalopatía Hepática (EH).
Para ello, en primer lugar se ha procedido a la confirmación de que el modelo animal empleado, ratas con derivación porto-cava, era un buen modelo para el estudio de la hiperamonemia asociada a EH. La observación de que las ratas-dpc presentan niveles de amonio en el plasma (303,98 ± 13,56 ?mol/l frente 97,50 ± 9,23 ?mol/l) y en el cerebro (8,39 ± 1,078,39 ± 1,07 ?mol/g de tejido frente a 3,44 ± 0,56 ?mol/g de tejido) significativamente mayor que el encontrado en las ratas controles operadas, pero sin practicar la derivación porto-cava (ratas-sham), y el comportamiento anómalo en el laberinto (test de aprendizaje: Y Maze test), indican que las ratas-dpc muestran un comportamiento propio de la EH.
Establecido el hecho de que los animales eran hiperamonémicos, que presentaban sintomatología propia de la Encefalopatía Hepática, y teniendo en cuenta que concentraciones altas de amonio (hiperamonemia) podrían causar estrés oxidativo, fundamentalmente a nivel del cerebro, procedimos a investigar esta hipótesis en el modelo animal citado. Para lo que, inicialmente, centramos nuestra atención en el estudio de la producción de oxidantes activos y de marcadores de estrés oxidativo relacionados con los lípidos y las proteínas.
La producción de oxidantes activos se ha llevado a cabo mediante el método de la diclorofluoresceina-diacetato (DCFH-DA), observándose que la - 2 - producción de este tipo de sustancias es significativamente mayor en las ratasdpc (247%) que en la ratas-sham (100%).
Dado que el método de la DCFH-DA mide fundamentalmente las especies reactivas de oxígeno (ERO), se procedió a medir la producción de óxido nítrico (NO) como índice de producción de las especies reactivas de nitrógeno (ERN), observándose que la producción de NO en la ratas-dpc era significativamente mayor que en las ratas-sham (21,80±1,57 ?moles/mg proteína frente a 14,76±1,26 ?moles/mg proteína, respectivamente).
La oxidación lipídica se ha medido por tres métodos diferentes: sustancias ácido tiobarbitúrico reactivas (TBARS), malondialdehído (MDA) y 4- hidroxi-2-nonenal (HNE), obteniéndose, en todos los casos, mayores índices de oxidación lipídica en las ratas-dpc que en las ratas-sham: 0,180 ± 0,020 ?moles eq-MDA/mg proteína frente a 0,112± 0,023 ?moles eq-MDA/mg proteína; 0,062±0,006 ?moles MDA/mg proteína frente a 0,021±0,004 ?moles MDA/mg proteína y 0,018±0,003 ?moles HNE/mg proteína frente a 0,008±0,002 ?moles HNE/mg proteína, respectivamente.
La oxidación de proteínas se ha estudiado midiendo los niveles de grupos carbonilos. La determinación del contenido en grupos carbonilos se ha llevado a cabo mediante el método de dinitrofenil hidrazina (DNPH), observándose que la oxidación de restos aminoacídicos en las proteínas de las ratas-dpc es significativamente mayor en las proteínas de las ratas-sham, 4,70±0,57 nmoles/mg proteína frente a 2,72±0,24 nmoles/mg proteína, respectivamente.
Estos resultados apuntan claramente hacia una participación directa del estrés oxidativo en las ratas-dpc, pero no nos dicen nada sobre los mecanismos y proteínas/enzimas implicados en el desarrollo fisiopatológico de la EH.
Con el fin de investigar qué proteínas/enzimas podrían estar implicadas en la fisiopatología observada en las ratas-dpc hemos procedido a estudiar la expresión diferencial de proteínas en ratas-dpc y ratas-sham, ya que una expresión diferencial de proteínas/enzimas implicadas en el metabolismo del nitrógeno, sistemas antioxidantes celulares, receptores de membrana y/o relacionadas con el hinchamiento de los astrocitos, podrían contribuir a explicar y entender mejor la fisiopatología de la EH. Además, teniendo en cuenta que dichas alteraciones también podrían ser debidas a modificaciones posttraduccionales, fundamentalmente oxidativas, también han sido estudiadas.
La expresión diferencial de proteínas en el cerebro de ratas-dpc y ratassham se ha estudiado en dos centros: corteza cerebral y cerebelo, mediante la técnica de DIGE (Differential In Gel Electrophoresis) y marcaje mínimo (minimal label), ya que mediante esta técnica se minimizan los errores instrumentales, de manipulación e interpretación de resultados. De los resultados obtenidos, tanto en corteza cerebral como en cerebelo, no podemos concluir que exista una expresión de proteínas estadísticamente significativa entre las ratas-dpc y las ratas-sham. Si bien, sí hemos observado una expresión diferencial sistemática para un grupo de proteínas relacionadas con la EH.
El estudio de la oxidación de proteínas (carbonilación) en el cerebro de ratas-dpc y ratas-sham mediante técnicas oxi-proteómicas utilizando la DNPH como marcador de grupos carbonilos, revela que las proteínas del cerebro de ratas-dpc están más oxidadas que las del cerebro de ratas-sham (4,70±0,57 nmoles/mg proteína frente a 2,72±0,24 nmoles/mg proteína, respectivamente). Además, no todas las proteínas del cerebro son igual de sensibles frente a los oxidantes activos (ERO y ERN, fundamentalmente) y que al menos 6 bandas (proteínas), en un gel 1D, (correspondientes a las bandas de 170, 120, 87, 54, 47 y 38 kDa) son más sensibles a la oxidación que el resto de proteínas (bandas). Así pues estas proteínas muestran un factor de oxidación (fox) mayor en las muestras de ratas-dpc que en las ratas-sham, lo que corrobora el estado de estrés oxidativo en las ratas-dpc. El estudio detallado de la oxidación de proteínas en el cerebro se ha llevado a cabo en la corteza cerebral y en el cerebelo mediante la técnica 2D-Oxy-blot.
Mediante el análisis de la oxidación de proteínas en cerebro mediante 2D Oxyblot hemos encontrado 16 spots en corteza (Tabla 1) y 12 spots en cerebelo (Tabla 2) que presentan un factor de oxidación (fox) mayor en ratasdpc con respecto a ratas-sham. Las proteínas que se han identificado a partir de esos spots mediante espectrometría de masas se muestran en las tablas indicadas.
La derivación porto-cava en ratas es un buen modelo de EH. Las ratasdpc muestran un claro estado de estrés oxidativo comprobado con los correspondientes biomarcadores (peroxidación lipídica y oxidación de proteínas). En el estudio de expresión diferencial de proteínas mediante la técnica del DIGE no se ha encontrado diferencias estadísticamente significativas ni en cerebelo ni en corteza. El estudio de modificaciones posttraduccionales oxidativas (carbonilación) mediante técnicas proteómicas (Redox-proteomic) revela que las ratas-dpc presentan un mayor nivel de oxidación que los animales control (ratas-sham) y que no todas las proteínas se oxidan por igual, habiendo proteínas más sensibles a la oxidación que otras. En este estudio hemos identificado 14 proteínas oxidadas en corteza y 12 en cerebelo: el 33% implicadas en el metabolismo energético; el 8% relacionadas con las proteínas de unión; el 8% implicadas en el transporte mediado por vesículas; el 33% forman parte del citoesqueleto; el 8% implicadas en la regulación de la expresión génica; el 5% relacionadas con la maquinaria implicada en la degadación de proteínas; y el 5% en otras funciones. La alteración de la mayor parte de estas proteínas puede relacionarse con la fisiopatología de la EH.
