Estudio de caracteres de interés en la mejora genética del almendro [Prunus dulcis (Miller) D.A. Webb] mediante estrategias ómicas, en un escenario de cambio climático

• Autores: Jordi Mas Gómez
• Directores de la Tesis: Pedro Jose Martinez Garcia (dir. tes.), Manuel Rubio Angulo (codir. tes.), Asunción Amorós Marco (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2025
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesualdo Tomás Fernández Breis (presid.), Francisca Hernández García (secret.), Luca Dondini (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Recursos y Tecnologías Agrarias, Agroambientales y Alimentarias por la Universidad Miguel Hernández de Elche
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• Resumen

  • El almendro (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb) es uno de los frutales de hueso más importantes a nivel mundial. En 2024, la producción global superó el millón y medio de toneladas de almendras sin cáscara, principalmente procedentes de California. El almendro es un árbol caducifolio con un período juvenil de 3-4 años, es autoincompatible, y se valora por su semilla, la almendra, con alto contenido en grasas insaturadas. Su origen se encuentra en Asia Central, donde fue domesticado hace 5.000 años. Posteriormente, se expandió hacia China y el área mediterránea y, en el siglo XVIII, fue introducido en California. Desde allí, se distribuyó a países del hemisferio sur como Australia y Sudáfrica.

    La influencia del ser humano ha dejado huellas claras de domesticación, como la pérdida del amargor y el incremento de tamaño de la semilla. Sin embargo, no fue hasta la primera mitad del siglo XX cuando surgieron los primeros programas de mejora genética. Desde entonces, programas desarrollados en distintos países han logrado comprender el mecanismo de autoincompatibilidad, obtener almendros autocompatibles, retrasar la fecha de floración para evitar heladas y aumentar la productividad respecto a las variedades tradicionales, entre otros logros.

    Actualmente, el almendro, al igual que otros cultivos se enfrenta a los efectos del cambio climático. Factores adversos como la falta de horas frío comprometen la salida del letargo y reducen la producción. Este efecto, es crítico, ya que las variedades de floración extra tardía suelen presentar baja productividad en zonas cálidas. Por otro lado, los periodos de sequía afectan negativamente a la producción, el tamaño y el peso de la semilla, así como a su composición nutricional. Estos caracteres son de gran importancia por su impacto comercial, tanto para el consumo directo como para la industria alimentaria, por ejemplo, en el turrón o el mazapán. En este sentido, es necesario desarrollar herramientas que permitan responder de manera más rápida y eficiente a estos retos en los programas de mejora, dado su largo ciclo de mejora.

    En los programas de mejora de almendro, se comenzó a emplear la biología molecular en los años noventa con el objetivo de aumentar la eficiencia de los procesos de selección. Se trabajó principalmente con marcadores moleculares, lo que permitió desarrollar estrategias de identificación de variedades, estudios de diversidad genética y construcción de mapas genéticos. Estos mapas han sido la base para identificar regiones del genoma asociadas a caracteres de interés, lo que se conoce como loci de caracteres cuantitativos (o QTLs, por sus siglas en inglés).

    Se identificaron marcadores asociados a caracteres como la fecha de floración, amargor de la semilla y auto incompatibilidad, siendo estos últimos los más utilizados en los programas de mejora. Sin embargo, a pesar del esfuerzo realizado por la comunidad científica, la selección asistida por marcadores (o MAS, por sus siglas en inglés) solo se ha implementado para unos pocos caracteres monogénicos. Por ello, la mejora genética del almendro no ha podido acelerarse para caracteres más complejos y cuantitativos.

    En este contexto, los avances en las nuevas tecnologías de secuenciación han permitido generar nuevos recursos genómicos de gran valor para afrontar estos retos. Hasta el momento se han ensamblado tres genomas de referencia de almendro, correspondientes a las variedades ‘Lauranne’, ‘Texas’ y ‘Nonpareil’. Estos genomas son fundamentales para los mejoradores, ya que permiten interpretar la arquitectura genética de los caracteres, y aplicar estrategias de genotipado más eficientes. Entre estas estrategias se incluyen el genotipado por secuenciación (o GBS, por sus siglas en inglés) y el desarrollo de chips de genotipado de alta densidad.

    Estas tecnologías permiten genotipar miles de marcadores (principalmente polimorfismos de un solo nucleótido (o SNPs, por sus siglas en inglés)) en grandes poblaciones a un coste reducido. Esto ha facilitado definir mejor la arquitectura genética de caracteres de interés, confirmar asociaciones previamente descritas mediante marcadores moleculares de baja densidad y descubrir nuevas asociaciones marcador-carácter a través de estudios de asociación de genoma completo (o GWAS, por sus siglas en inglés) y mapeo de QTL con mapas de alta densidad.

    La obtención de esta gran cantidad de marcadores ha favorecido el desarrollo de nuevas estrategias para acelerar la ganancia genética. La selección genómica (o GS, por sus siglas en inglés) es una estrategia que estima los valores genéticos de los individuos a partir de los efectos de los marcadores moleculares sobre un carácter. Para su implementación, es necesario entrenar modelos predictivos con datos fenotípicos y genotípicos. Estos modelos permiten predecir el valor genético de los individuos utilizando solo su genotipo. De este modo, es posible acelerar la ganancia genética mediante una estimación más precisa del valor genético del individuo y una selección temprana en la etapa de plántula. Aunque esta estrategia aún no se ha aplicado experimentalmente en almendro, es fundamental generar conocimiento sobre la arquitectura genética de los caracteres antes de su implementación.

    Los avances en genotipado han creado un nuevo escenario en el que el genotipo es accesible, pero el fenotipo constituye el principal cuello de botella. El fenotipo sigue siendo necesario para entrenar y validar los modelos de selección genómica. Por ello, en los últimos años se están desarrollando plataformas de fenotipado de alto rendimiento que sustituyen a los métodos tradicionales, frecuentemente tediosos, subjetivos o costosos.

    Esto ha dado lugar al surgimiento de un nuevo campo de investigación denominado fenómica. Nuevas herramientas como la visión por computadora, el uso de plataformas aéreas no tripuladas y la inteligencia artificial están aumentando la eficiencia del fenotipado, permitiendo evaluar cientos o miles de plantas y muestras. Los sensores de imagen RGB (siglas en inglés de ‘Red, Green and Blue’), han sido los más empleados hasta la fecha por su sencillez y se han utilizado para estudiar caracteres morfológicos de frutos, arquitectura de frutales y productividad. Además, sensores más avanzados como las cámaras hiperespectrales están comenzando a implementarse, lo que permite predecir con mayor precisión caracteres como la productividad, la resistencia a enfermedades o la composición nutricional. No obstante, los avances en fenómica para el almendro siguen siendo limitados.

    Por ello, en la presente tesis doctoral se busca mejorar la eficiencia de la mejora genética del almendro mediante el desarrollo de nuevas metodologías ómicas que permitan comprender mejor los caracteres de interés en almendro sujetos a los efectos del cambio climático.

    Se ha trabajado en la disección de la arquitectura genética de caracteres relacionados con la floración (Objetivo 1). Además, se ha desarrollado una plataforma de fenotipado de alto rendimiento empleando sensores de imagen RGB e hiperespectrales para fenotipar caracteres morfológicos (Objetivo 2) y de composición nutricional (Objetivo 3) de la almendra.

    En relación con el primer objetivo, se utilizó el nuevo chip de 60.000 SNPs de almendro para genotipar la colección de germoplasma y la población del cruzamiento ‘R1000 x Desmayo Largueta’, ambas pertenecientes al programa de mejora genética del CEBAS-CSIC. Esta última población se empleó para construir un mapa genético de alta densidad, en el que se logró mapear 1.108 marcadores con una densidad de 0,46 cM por marcador.

    El mapa, mostró una buena colinealidad con los genomas de referencia disponibles, y reveló posibles errores de ensamblado de los genomas, a través de discrepancias entre posiciones de marcadores en el mapa genético y en los genomas. Este mapa sirvió de base para mapear QTLs asociadas con la fecha e intensidad de floración. Para la fecha de floración, se definió con mayor resolución la QTL principal del cromosoma 4 y la secundaria del cromosoma 1. Para la intensidad de floración, se identificaron QTLs en los cromosomas 1, 4, 5 y 7, siendo estas últimas las primeras detectadas en Prunus. Estos resultados se integraron con los obtenidos de un estudio de GWAS realizado en la colección de germoplasma utilizando datos históricos. Esta integración permitió identificar 35 SNPs candidatos consistentes en ambas poblaciones, que mostraron 104 efectos sobre 62 genes mediante el análisis de predicción de los efectos de variantes.

    Estos genes se combinaron con 403 genes expresados diferencialmente en la salida de endodormancia en almendro, obtenidos mediante la secuenciación del ácido ribonucleico (ARN) o RNA-seq (siglas en inglés de Ribonucleic Acid sequencing). Los 403 genes se encontraban dentro de las QTLs identificadas y se obtuvieron reanalizando datos previos disponibles en bases de datos públicas. Las proteínas codificadas por los genes obtenidos se utilizaron para crear una red de interacciones proteína-proteína. Este conjunto final de genes y sus interacciones revelaron nuevos genes candidatos con anotaciones funcionales relacionadas con especies reactivas de oxígeno, giberelinas, ácido abscísico, rafinosa, biosíntesis de folato y actividad de cetoacil-CoA sintasa.

    En relación con el segundo objetivo, se desarrolló un flujo de trabajo en Python para fenotipar caracteres morfológicos, morfométricos y de color en frutos mediante imágenes RGB. El flujo de trabajo permite generar modelos de segmentación propios mediante el ajuste fino (en inglés fine-tuning) de modelos preentrenados basados en la arquitectura YOLO (acrónimo en inglés de ‘You only look once’). Se elaboraron instrucciones, un repositorio de GitHub y un videotutorial para su implementación de forma simple y accesible. Esta estrategia fue evaluada con distintos conjuntos de imágenes de almendras sin cáscara y con cáscara, mostrando tasas de error inferiores al 2%. Se llegaron a fenotipar más de 45.000 almendras, lo que constituye el mayor conjunto de datos fenotípicos generado hasta la fecha en almendro.

    También se evaluaron estrategias para medir el espesor de las almendras combinando medidas de área y de peso. Los resultados mostraron una raíz del error cuadrático medio (o RMSE, por sus siglas en inglés) inferior a 5 mm. Además, el flujo de trabajo incluyó análisis morfométricos que produjeron caracteres cuantitativos sobre la forma de la almendra, lo que facilitará su integración en nuevas estrategias de mejora como la selección genómica. Por último, se estimó la heredabilidad en sentido amplio de los caracteres estudiados. En total, 55 caracteres presentaron valores superiores a 0,25, siendo la relación de aspecto (largo-ancho) y el largo de la semilla altamente heredables.

    En relación con el tercer objetivo, se desarrolló una plataforma de fenotipado de alto rendimiento mediante imágenes hiperespectrales y un flujo de trabajo abierto en Python para fenotipar la composición nutricional de las muestras de almendras. Las imágenes hiperespectrales abarcaron el rango del infrarrojo de onda corta (900-1.750 nm) para cada píxel de la imagen. Esta información espectral se empleó para predecir componentes nutricionales como el contenido en grasa, proteína, fibra, sacarosa, ácidos grasos y fitoesteroles. El flujo de trabajo integró las estrategias de segmentación desarrolladas en el objetivo previo, técnicas de preprocesamiento espectral, análisis exploratorios y modelado mediante regresión multivariante por mínimos cuadrados parciales (o PLS, por sus siglas en inglés). Además, incluyó una estrategia de selección de variables con mejoras adicionales. Esta estrategia de fenotipado masivo permitió fenotipar más de 600 individuos, multiplicando por seis el número de individuos estudiados en estudios previos en almendro y otros frutos secos. Las predicciones de los componentes principales como la grasa y la proteína mostraron altas precisión, con RMSE cercanos al 1%.

    Finalmente, la heredabilidad en sentido estricto (h²) de estos caracteres de interés se estimó mediante modelos lineales mixtos, utilizando distintas matrices de parentesco: la matriz del pedigrí en el modelo de la Mejor Predicción Lineal Insesgada (o BLUP, por sus siglas en inglés), la matriz genómica en el modelo de la Mejor Predicción Lineal Insesgada Genómica (o GBLUP, por sus siglas en inglés), y la matriz combinada de pedigrí y genómica en el modelo híbrido de BLUP en un solo paso (o ss-BLUP, acrónimo en inglés de ‘single-step BLUP’). Los resultados mostraron la importancia de los efectos aditivos para caracteres como el contenido de grasa, con valores de h² entre 0,5 y 0,6.

    Para hacer frente a los efectos del cambio climático en la producción de almendro, será necesario acelerar los programas de mejora genética. Las metodologías desarrolladas y los resultados obtenidos en la presente tesis han demostrado un incremento en la eficiencia del fenotipado y un mayor conocimiento de la arquitectura genética de caracteres de interés. La integración de estas herramientas y conocimiento en nuevas estrategias de mejora, como la selección genómica, será determinante para su implementación efectiva en los programas de mejora de almendro.