Control of replication fork stability by chromatin and s-phase checkpoint

• Autores: Iván Núñez Martín
• Directores de la Tesis: Andrés Aguilera López (dir. tes.), Belén Gómez González (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2026
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 239
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  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • La información genética debe permanecer inalterada en el ADN para el correcto funcionamiento celular. Sin embargo, el ADN está expuesto a diversas fuentes de daño que pueden generar inestabilidad genómica. Entre las lesiones más comunes se encuentran los cortes de cadena sencilla. Sin embargo, los de cadena doble, aun siendo poco habituales, se consideran las lesiones más tóxicas para la célula. Si no se reparan eficazmente, pueden dar lugar a mutaciones y alteraciones cromosómicas, por lo que existen mecanismos especializados para prevenir o resolver las amenazas que potencialmente comprometen la estabilidad del genoma.

    La información genética debe duplicarse con exactitud en un proceso conocido como replicación del ADN. Sin embargo, diversos obstáculos pueden comprometer su integridad. La detección de obstáculos que impiden el avance de las horquillas de replicación, así como su coordinación con los mecanismos de reparación se lleva a cabo mediante el checkpoint de fase S.

    Los conflictos con la transcripción pueden impedir la progresión de la replicación, destacando el papel de los bucles R, cuya acumulación no programada es una fuente importante de estrés replicativo. Dado que ambos procesos ocurren en el contexto de la cromatina, existe una estrecha conexión entre los factores que la regulan, la transcripción, la replicación y la reparación del ADN.

    En esta tesis se plantearon dos objetivos para entender los mecanismos moleculares que preservan la estabilidad del genoma usando la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo.

    En primer lugar, para explorar el papel de la cromatina en la prevención de la inestabilidad genómica asociada a la transcripción, hemos realizado un escrutinio genético de una colección de mutantes de las histonas H3 y H4, determinando los niveles de recombinación en sistemas plasmídicos en los que podíamos regular la transcripción. Hemos identificado dos mutaciones, H4K5R y H3T80D, que aumentan los niveles de recombinación dependientes de transcripción y otros fenotipos asociados a inestabilidad genómica. Mediante un análisis genómico de la progresión de las horquillas de replicación observamos que ambos mutantes presentan diferentes patrones de fragilidad. Estudios de la sensibilidad de los mutantes identificados frente a diferentes agentes genotóxicos revelaron que, en el caso de H4K5R, detectamos una acumulación de daño dependiente de bucles R que aumenta la sensibilidad a estrés replicativo, el cual favorece la formación de roturas dependientes de la endonucleasa Mus81. Por el contrario, observamos que el mutante H3T80D es sensible a radiación ultravioleta, debido a que el proceso de reparación por escisión de nucleótidos estaba alterado por la retención excesiva del complejo TFIIH tras la acción de las endonucleasas Rad1 y Rad2. Como consecuencia, las lesiones inducidas por ultravioleta daban lugar a huecos de cadena sencilla en el ADN que se convierten en roturas de doble cadena tras la replicación.

    En segundo lugar, para identificar factores implicados en el colapso de horquillas cuando el checkpoint de fase S no es funcional, se realizaron experimentos de re-expresión controlada de Rad53 junto a diversos candidatos que revelaron la implicación de Rad51, Mus81 y Rad5. Además, observamos cómo la sobreexpresión de Mre11 suprime esta letalidad. El análisis de incorporación de BrdU nos ha permitido demostrar que dicha pérdida de viabilidad se asocia a una degradación del ADN naciente que depende de Rad51, Mus81, Rad5 y Exo1. Estos resultados sustentan un modelo en el que, en ausencia del checkpoint, la acción de Rad51 y Rad5 promueve un intermediario de replicación que sirve de sustrato para el corte de Mus81 y la posterior degradación masiva por exonucleasas. Finalmente, observamos que la expresión heteróloga de la enzima humana PrimPol es capaz de rescatar los fenotipos de sensibilidad a estrés replicativo y degradación que se observan en ausencia del checkpoint de fase S.