Ca10 Carbohydrate as a target for the development of a cancer immunotherapy based on CAR-T cells
- Autores: Beatriz Amoros Perez
- Directores de la Tesis: Manuel Gómez del Moral (dir. tes.), Eduardo Martínez Naves (dir. tes.), José Luis Subiza Garrido-Lestache (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2024
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 190
- Títulos paralelos:
- El carbohidrato Ca10 como diana para el desarrollo de una inmunoterapia contra el cáncer basada en células CAR-T
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Manuel Martín Villa (presid.), Sara González García (secret.), Carlos del Fresno Sánchez (voc.), Carlota García-Hoz Jiménez (voc.), Belén Blanco Durango (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Investigación Biomédica por la Universidad Complutense de Madrid
- Menciones:
- Industrial
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
- Resumen
- español
Introducción La terapia CAR-T constituye una de las terapias más innovadoras para el tratamiento del cáncer, pero todavía no existe ninguna terapia CAR-T aprobada para el tratamiento de tumores sólidos. El proceso de transformación maligna se ha asociado a la aparición de patrones aberrantes de glicosilación, por eso, en este trabajo proponemos como diana Ca10, un proteoglicano de heparán sulfato presente en adenocarcinomas humanos. Este proteoglicano es reconocido específicamente por el anticuerpo monoclonal A10 y en estudios previos, la inmunización con este antígeno produjo una respuesta humoral específica y protección frente al desarrollo del tumor sólido de Ehrlich que expresa alta densidad de Ca10 en la superficie celular. Por tanto, el principal objetivo de este trabajo fue desarrollar un CAR-T específico para Ca10 utilizando como modelo el tumor múrido de Ehrlich. Un objetivo secundario de esta tesis fue estudiar los mecanismos moleculares implicados en la aparición del antígeno Ca10 en las células tumorales. Resultados En primer lugar, generamos la región de reconocimiento del antígeno del CAR (A10- ScFv), la cual fue capaz de unirse al antígeno soluble Ca10 mediante ELISA y también de reconocer células Ca10+ por citometría de flujo. Para llevar a cabo los ensayos funcionales, desarrollamos dos modelos de células Ca10CAR-T mediante transducción lentiviral de células Jurkat (Ca10CAR-Jurkat) y células T primarias (Ca10CAR-T), que expresaron con gran eficiencia el Ca10CAR en la superficie celular. Cuando se cultivaron con células tumorales de Ehrlich (Ca10+) observamos que las células Ca10CAR-Jurkat aumentaban la expresión de CD69 y la polarización de PLC fosforilada (pPLC) en la membrana celular. Las células Ca10CAR-T primarias secretaban una mayor cantidad de citoquinas proinflamatorias como IFN- y TNF- cuando se cultivaron con células tumorales de Ehrlich en comparación con el cultivo con células S180 (con muy baja expresión de Ca10-) y células CAR-T solas. Además, demostramos que las células Ca10CAR-T tienen una actividad citotóxica in vitro específica frente a células tumorales de Ehrlich. En ensayos in vivo realizados en ratones NSG, se observó una disminución del crecimiento tumoral cuando las células Ca10CAR-T se inoculaban directamente en el tumor sólido de Ehrlich. Además, los ratones tratados con CAR-T presentaban un mayor infiltrado de células T. En cuanto al mecanismo molecular responsable de la aparición del antígeno tumoral, Nuestra hipótesis era que el carbohidrato Ca10 podría ser el resultado de un proceso aberrante de glicosilación como consecuencia de alteraciones en uno o más genes implicados en la expresión de proteoglicano de heparán sulfato. Para comprobar esta hipótesis realizamos un análisis transcriptómico de líneas celulares Ca10+ y Ca10-. Nuestros resultados mostraron que genes que codifican enzimas implicadas en la síntesis y modificación de PGHS tenían su expresión incrementada (Ext1, Ext2, Sulf1, Hs3st6 y Hs6st1) o disminuida (Papss1, Hgsnat, Sulf2 y Hs3st1) en células Ca10+ frente a Ca10- )por lo que son posibles candidatos para explicar la expresión de Ca10 en las células de Ehrlich. Conclusión Hemos logrado diseñar y expresar un CAR específico de Ca10 en células Jurkat y linfocitos T primarios humanos que es capaz de reconocer específicamente el antígeno. Además, tanto las células Ca10CAR-Jurkat como las Ca10CAR-T se activan tras el cultivo con células tumorales de Ehrlich y muestran citotoxicidad específica contra estas células tumorales, con alta expresión del antígeno Ca10. Los ensayos in vivo sugieren que la inoculación intratumoral de células Ca10CAR-T podría retrasar el crecimiento del tumor de Ehrlich. Por último, se han identificado 9 genes implicados en la síntesis y modificación de PGHS que pueden estar implicados en la aparición del antígeno Ca10
- English
Chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy represents a groundbreaking approach to cancer treatment, with remarkable outcomes observed in the management of hematological malignancies through the approval of therapies targeting CD19 and BCMA antigens. Nevertheless, there is currently no CAR-T cell-based therapy for the treatment of solid tumors. This is due to the difficulty in identifying tumor-specific antigens and the challenging trafficking and infiltration of T cells into tumors, in addition to the presence of an immunosuppressive tumor microenvironment, among other constraints. The process of malignant transformation has been associated with the appearance of aberrant glycosylation patterns. Therefore, in this study, we propose Ca10, a heparan sulfate proteoglycan present in human adenocarcinomas, as a potential target. This proteoglycan is specifically recognized by the monoclonal antibody A10. Previous studies have demonstrated that immunization with this antigen produces a specific humoral response and provides protection against the development of Ehrlich solid tumor, which expresses high levels of Ca10 on its cell surface...
- español
