Análisis de la redundancia funcional en la familia génica cupuliformis de arabidopsis
- Autores: Lucía Juan Vicente
- Directores de la Tesis: José Luis Micol Molina (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Miguel Hernández de Elche ( España ) en 2025
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José Martín Nieto (presid.), Sara Jover Gil (secret.), Julia Rosl Weiss (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioingeniería por la Universidad Miguel Hernández de Elche
- Materias:
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- Resumen
En esta tesis convergen tres iniciativas del laboratorio del Prof. José Luis Micol, cuyo nexo es la genética del desarrollo de las plantas en general y, en particular, una de sus facetas: el control genético y epigenético de la morfogénesis foliar. Nos hemos preguntado en primer lugar hasta qué punto son fructíferas las búsquedas de mutantes que manifiesten alteraciones morfológicas visibles en uno de sus órganos, como las hojas, para realizar una disección genética de su morfogénesis. Estas búsquedas a gran escala, fundamentadas en la fuerza bruta, implican un esfuerzo descomunal, pero sus resultados pueden ser decisivos y, en ocasiones, seminales. También hemos revisado la literatura científica relativa al control genético de la bilateralidad, una propiedad de muchos seres vivos que caracteriza tanto la arquitectura corporal de la mayoría de los animales como ciertos órganos de las plantas, como las hojas. La información que hemos compilado y nuestras reflexiones sobre estas dos cuestiones se han recogido en dos artículos de revisión integrados en esta tesis, uno de ellos publicado, y el otro, en preparación.
A lo largo de la década de los 90 se realizaron en el laboratorio de J.L. Micol varias búsquedas de mutantes de Arabidopsis thaliana (en adelante, Arabidopsis) que manifestaran alteraciones en la forma, el tamaño o el color de las hojas de su roseta basal, con el objetivo de identificar genes implicados en la organogénesis foliar. Estos mutantes fueron asignados a clases fenotípicas para facilitar su análisis genético, que reveló que 208 de ellos correspondían a 144 grupos de complementación. Del estudio de 105 de estos mutantes se concluyó que eran portadores de alelos de 63 genes, en su mayoría hipomorfos o nulos. Las primeras publicaciones sobre la identificación y caracterización de 13 de dichos genes, derivadas del estudio de 21 mutantes, fueron reseñadas en una revisión publicada en 2009. Hemos elaborado una segunda revisión, como primera parte de esta tesis, en la que se glosan otros 38 genes, cuya identificación y caracterización se ha publicado a lo largo de los últimos 16 años. Una de las conclusiones de nuestra revisión es que los genes causantes de las alteraciones de la morfología foliar de los mutantes aislados y estudiados en el laboratorio de J.L. Micol son necesarios para la organogénesis de la hoja, aunque no actúan de manera exclusiva en este proceso, ya que están implicados en funciones celulares básicas que también resultan esenciales para el desarrollo de otros tejidos y órganos. Por ejemplo, los mutantes portadores de alelos nulos de ocho de los genes estudiados manifiestan un único rasgo fenotípico visible: sus hojas son estrechas, apuntadas e indentadas. Sin embargo, los productos de los correspondientes genes forman parte inequívocamente de la maquinaria de la traducción. El fenotipo foliar que estas mutaciones causan podría explicarse por una traducción insuficiente de determinados ARN mensajeros, como los que codifican factores de la señalización por la auxina, o por los grandes requerimientos de proteínas que conlleva la división y la expansión de las células durante el crecimiento de la hoja.
La categoría más representada entre los mutantes estudiados es la de los 14 genes nucleares que codifican proteínas del cloroplasto. Las hojas de estos mutantes son cloróticas o reticuladas, debido a la depleción de los pigmentos fotosintéticos. Los mutantes portadores de alelos de cuatro genes cuyos productos participan en construcción de la pared celular presentan fenotipos pleiotrópicos, con alteraciones del tamaño de la planta y de la morfología y la ploidía foliares. El fenotipo morfológico de los mutantes deficientes en la homeostasis de la auxina, que corresponden a siete genes, es diverso, dada la gran cantidad de procesos celulares básicos regulados por esta hormona. También es heterogéneo el grupo de los cuatro mutantes no alélicos cuya biogénesis de los microARN es aberrante, debido al gran número de genes cuya regulación postranscripcional depende de estas moléculas. Aunque son siete los mutantes identificados en el laboratorio de J.L. Micol cuyo fenotipo foliar se debe a alguna deficiencia de la maquinaria epigenética, solo uno de ellos, incurvata11-1 (icu11-1), se ha analizado en detalle después de 2009, tal como se indica más adelante en este resumen.
Aunque en la revisión comentada hasta aquí hemos reseñado resultados derivados de abordajes experimentales basados en la genética directa, en el laboratorio de J.L. Micol también se realizó una búsqueda de mutantes a gran escala basada en la genética inversa, aprovechando la existencia de la colección SALK de líneas insercionales de Arabidopsis. Se sometieron a escrutinio 19.500 estirpes mutantes y se seleccionaron las 608 que manifestaron alteraciones en su morfología foliar y resultaron ser no segregantes. Una de ellas, a la que se denominó inicialmente desigual1-1 (deal1-1), manifestó un rasgo morfológico poco frecuente: la ruptura de la simetría bilateral que caracteriza las hojas de Arabidopsis. Se ha establecido recientemente en el laboratorio de J.L. Micol que dicha asimetría podría deberse a la alteración de la participación de las citoquininas en la morfogénesis del margen foliar.
Se asume generalmente que la simetría es una propiedad esencial de los seres vivos y que el desarrollo está bajo control genético y epigenético tanto en las plantas como en los animales. De hecho, el 99% de los animales presentan simetría bilateral. Ejemplo de ello son los mamíferos, cuya arquitectura corporal es fundamentalmente bilateral, aunque también incluye estructuras inherentemente asimétricas, como el corazón, usualmente desplazado hacia la izquierda de la cavidad torácica. Se han descrito algunos de los mecanismos genéticos que participan en el establecimiento de dichas asimetrías, pero se sabe bien poco acerca de los genes que especifican y/o mantienen la simetría bilateral. En esta tesis hemos plasmado, en una revisión pendiente de aceptación, nuestras reflexiones al respecto de la aparente paradoja a la que la mentalidad genética se enfrenta al analizar la simetría bilateral en los seres vivos, ya que en muchos casos parece que no existan genes para crearla, pero sí para desviarse de ella. Nuestro objetivo principal en esta revisión ha sido destacar la sorprendente escasez de información acerca de los genes que establecen y/o mantienen la simetría bilateral en las plantas y los animales. Merece mención, no obstante, que está bien establecido que a lo largo de la evolución de las angiospermas se han producido en diferentes clados transiciones entre la simetría bilateral y la radial de las flores, en ambos sentidos, que han sido explicados como una consecuencia de la adaptación a los polinizadores y el clima.
Como tercera parte de esta tesis, hemos abordado experimentalmente aspectos no estudiados anteriormente del análisis funcional de los miembros de la familia génica CUPULIFORMIS (CP), que está representada en el genoma de Arabidopsis por cinco genes: INCURVATA11 (ICU11), CP2, CP3, CP4 y CP5. Pretendíamos determinar el origen y el grado de conservación evolutiva de la función de los miembros de la familia CP, así como establecer si CP3, CP4 y CP5 eran componentes de la maquinaria epigenética, tal como se ha demostrado para sus parálogos ICU11 y CP2. La familia CP fue descubierta merced al análisis genético y molecular del mutante icu11-1, cuyas hojas son hiponásticas, a diferencia de las relativamente planas del tipo silvestre. La familia CP pertenece a la superfamilia de las dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato y hierro II (2OGD), que son enzimas oxidativas que emplean 2-oxoglutarato y oxígeno como cosustratos y Fe2+ como cofactor. ICU11 y su parálogo más cercano, CP2, forman parte de la maquinaria epigenética de Arabidopsis y manifiestan redundancia funcional desigual. A pesar de que el fenotipo causado por los alelos nulos de ICU11 y CP2 es relativamente débil e indistinguible del silvestre, respectivamente, sus dobles mutantes son letales. En efecto, las plantas icu11 cp2 pasan sin transición de la germinación al desarrollo reproductivo, como consecuencia de la desrepresión ectópica y heterocrónica de genes de identidad floral, que permanecen reprimidos epigenéticamente durante la fase vegetativa del ciclo de vida de los tipos silvestres de Arabidopsis.
Durante el transcurso de esta tesis, el grupo de C. Dean demostró que la proteína ICU11 participa en el silenciamiento de FLOWERING LOCUS C (FLC) durante la vernalización, y que además actúa como proteína accesoria del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), ya que coinmunoprecipita con varios de los componentes principales y con otras proteínas accesorias de este complejo. El grupo de J.L. Micol realizó escrutinios basados en la purificación mediante afinidad en tándem y ensayos de complementación de fluorescencia bimolecular que confirmaron estos últimos resultados y revelaron además que CP2 también se comporta como una proteína accesoria del PRC2.
Hemos estudiado la evolución de los genes de la familia CP. Por un lado, dado que Arabidopsis es una traqueófita, angiosperma, dicotiledónea y brasicácea, hemos realizado ensayos de expresión heteróloga en el mutante icu11-1 de genes de la familia CP de la brasicácea Brassica rapa, la monocotiledónea Oryza sativa y la briófita Physcomitrella patens, a fin de establecer su eventual conservación funcional en el reino vegetal. Hemos constatado así que los ortólogos de ICU11 y CP2 de Arabidopsis en Oryza sativa y Brassica rapa, respectivamente, rescatan parcialmente el fenotipo de icu11-1, lo que sugiere la conservación de la función de estos genes entre las angiospermas.
También hemos realizado un análisis filogenético de los miembros de la familia CP con especies representativas de diferentes clados del reino vegetal. Todas las especies analizadas tienen un ortólogo de ICU11, y la mayoría de las dicotiledóneas, también otro de CP2. ICU11 parece representar al gen ancestral fundador de la familia, de cuya primera duplicación probablemente derivó CP2. CP3, CP4 y CP5 son más recientes, ya que han aparecido durante la diversificación de las Brasicáceas.
También hemos obtenido mutantes portadores de alelos insercionales y presuntamente nulos de CP3, CP4 y CP5, que resultaron fenotípicamente silvestres. Para establecer la eventual existencia de redundancia entre estos genes, hemos obtenido todas sus combinaciones mutantes múltiples. Hemos usado la tecnología CRISPR/Cas9 para obtener dobles mutantes cp4 cp5, dado que CP4 y CP5 están íntimamente ligados. También hemos obtenido combinaciones cuádruples de alelos de ICU11 o CP2 con los de CP3, CP4 y CP5. El fenotipo morfológico de los triples mutantes cp3 cp4 cp5 y los cuádruples cp2 cp3 cp4 cp5 es indistinguible del silvestre; el de los mutantes cuádruples icu11 cp3 cp4 cp5 es indistinguible del de los mutantes simples icu11.
Hemos construido fusiones traduccionales de CP3, CP4 o CP5 con el gen de la proteína fluorescente verde, que hemos expresado transitoriamente en Nicotiana benthamiana. CP3, CP4 y CP5 resultaron ser nucleares en estos ensayos, al igual que ICU11 y CP2. El análisis in silico de la expresión de CP3, CP4 y CP5 en Arabidopsis indica que se transcriben muy poco, y solo se ha demostrado la existencia de la proteína CP4. La sobreexpresión de CP3, CP4 o CP5 de Arabidopsis no rescata el fenotipo del mutante icu11 1.
No hemos encontrado evidencia alguna de la existencia de funciones de CP3, CP4 o CP5 y hemos descartado la redundancia funcional de estos genes, entre sí y respecto a los del clado constituido por ICU11 y CP2. Resultan llamativas, sin embargo, la conservación de la secuencia de CP3, CP4 y CP5, que no parecen haber sufrido las mutaciones que suelen manifestar los pseudogenes, así como de la capacidad de las proteínas CP3, CP4 y CP5 de ser importadas al núcleo. No podemos descartar, en consecuencia, que los genes CP3, CP4 y CP5 hayan adquirido nuevas funciones, cuya naturaleza no hemos logrado establecer.
