Modeling ANKRD11 Dysfunction in Zebrafish to Elucidate Molecular Mechanisms of Skeletal Pathogenesis in KBG Syndrome

• Autores: Haleh Nikzamir
• Directores de la Tesis: Diana García Moreno (dir. tes.), Alicia Martínez López (dir. tes.), Victoriano Francisco Mulero Méndez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2025
• Idioma: español
• Número de páginas: 181
• Tribunal Calificador de la Tesis: María L. Cayuela Fuentes (presid.), Berta Almoguera Castillo (secret.), Alejandro Barrallo Gimeno (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
• Resumen
  • español

    Objetivos Este estudio tuvo como objetivo establecer y caracterizar dos líneas de pez cebra generadas mediante CRISPR–Cas9 (ANK1 y ΔRD2) como modelos del síndrome de KBG, definir las anomalías morfológicas y transcriptómicas asociadas a la deficiencia de Ankrd11, y comparar estos hallazgos con perfiles transcriptómicos de 14 pacientes con KBG para explorar relaciones genotipo–fenotipo. Asimismo, se buscó investigar los mecanismos moleculares alterados por la disfunción de Ankrd11 y evaluar los efectos de intervenciones farmacológicas dirigidas, con el fin de identificar vías de relevancia terapéutica.

    Metodología Se generaron dos líneas mutantes de pez cebra: ANK1, que conserva el dominio de repeticiones de ankirina N-terminal, y ΔRD2, carente del dominio represor C-terminal 2. Los análisis morfológicos incluyeron tamaño corporal, pigmentación, desarrollo craneofacial, inflado de la vejiga natatoria e integridad del pliegue de la aleta. El fenotipo conductual se evaluó bajo ciclos luz–oscuridad utilizando el sistema Danio Vision. La dinámica celular mesenquimal se estudió mediante microscopía confocal y de lapso de tiempo en líneas transgénicas Tg(7xTCF-Xla.Siam:nls-mCherry), lo que permitió la visualización y cuantificación de células Wnt⁺. Se realizaron análisis transcriptómicos en larvas y en leucocitos de sangre periférica de pacientes, seguidos de estudios de expresión diferencial, ontología génica y enriquecimiento de motivos de factores de transcripción. Ensayos farmacológicos evaluaron los efectos de inhibidores de caspasa-6 y RIPK1, así como la modulación de la señalización tiroidea, sobre la morfología del pliegue de la aleta y la abundancia celular mesenquimal.

    Resultados y Conclusión Los mutantes homocigotos ANK1 y ΔRD2 mostraron anomalías graves del desarrollo, incluidas lesiones tempranas en el pliegue de la aleta, dismorfogénesis craneofacial, curvatura espinal, hipopigmentación y reducción de la supervivencia. Los estudios conductuales confirmaron una actividad locomotora significativamente disminuida en comparación con los controles. Las lesiones del pliegue de la aleta fueron el fenotipo más temprano y penetrante, detectable a los tres días post-fertilización.

    La microscopía confocal reveló una reducción marcada de células mesenquimales Wnt⁺, con alteraciones nucleares, menor tamaño y motilidad reducida. Estos defectos no se asociaron a apoptosis, lo que sugiere alteraciones en la especificación o proliferación de progenitores. El análisis transcriptómico mostró un agrupamiento dependiente del genotipo y un enriquecimiento en rutas relacionadas con remodelación de la matriz extracelular, regulación del citoesqueleto y procesos de desarrollo. El análisis de motivos de factores de transcripción confirmó una disrupción de la señalización Wnt/β-catenina mediante enriquecimiento de motivos TCF/LEF.

    Los ensayos funcionales revelaron potencial terapéutico en la modulación de vías específicas. La inhibición farmacológica de caspasa-6 o RIPK1 restauró parcialmente el número de células mesenquimales y mejoró la morfología del pliegue de la aleta, implicando a estos factores en la regulación no apoptótica de progenitores. La modulación hormonal mostró efectos dependientes del genotipo: la tiroxina agravó las lesiones, mientras que la inhibición de la producción de hormonas tiroideas o la reducción de serpina7 mejoraron los fenotipos, lo que indica una interacción entre señalización tiroidea y regulación mesenquimal mediada por Wnt.

    En pacientes, el análisis transcriptómico no reveló correlaciones consistentes entre el tipo de mutación en ANKRD11 y la gravedad clínica, lo que sugiere la participación de modificadores adicionales.

    En conjunto, este trabajo establece al pez cebra como un modelo robusto para estudiar la deficiencia de Ankrd11 y sus consecuencias esqueléticas. Los resultados demuestran que la pérdida de Ankrd11 interrumpe la señalización Wnt/β-catenina, reduce los progenitores mesenquimales e impide una correcta morfogénesis esquelética. La recuperación parcial mediante inhibidores de caspasa-6, RIPK1 y moduladores hormonales identifica posibles dianas terapéuticas y subraya la relevancia traslacional de estos hallazgos. Este estudio proporciona nuevas bases mecanísticas para comprender la patogénesis del síndrome de KBG y abre perspectivas para el desarrollo de terapias específicas.

  • English

    This study aimed to establish and characterize two CRISPR–Cas9–generated zebrafish lines (ANK1 and ΔRD2) as models of KBG syndrome, to define morphological and transcriptomic abnormalities associated with Ankrd11 deficiency, and to compare these findings with transcriptomic profiles from 14 KBG patients to explore genotype–phenotype relationships. Additionally, the work sought to investigate the molecular mechanisms disrupted by Ankrd11 dysfunction and to assess the effects of targeted pharmacological interventions, with the goal of identifying candidate pathways of therapeutic relevance.

    Methodology Two independent ankrd11 mutant zebrafish lines were generated: ANK1, carrying a truncation that preserves the N-terminal ankyrin repeat domain, and ΔRD2, lacking the C-terminal repression domain 2. Morphological analyses included body size, pigmentation, craniofacial development, swim bladder inflation, and fin fold integrity assessed through lesion scoring. Behavioral phenotyping was performed under light–dark cycle stimulation by Danio Vison system. To investigate mesenchymal cell dynamics, high-resolution confocal and time-lapse imaging were carried out in Tg(7xTCF-Xla.Siam:nls-mCherry) transgenic zebrafish, enabling visualization and quantification of Wnt⁺ cells in the fin fold region. RNA sequencing of zebrafish larvae and of patient peripheral blood leukocytes was conducted followed by differential expression, gene ontology, and transcription factor motif enrichment analyses. Pharmacological assays tested the effects of caspase-6 and RIPK1 inhibitors, alongside modulation of thyroid hormone signaling, on fin fold morphology and mesenchymal cell number.

    Results and Conclusion Both ANK1 and ΔRD2 homozygous zebrafish mutants exhibited severe developmental abnormalities, including early-onset fin fold lesions, craniofacial dysmorphogenesis, spinal curvature, hypopigmentation, and reduced survival. Behavioral studies confirmed significantly impaired locomotor activity in mutants relative to wild-type siblings. Fin fold lesions emerged as the earliest and most penetrant phenotype, consistently detected by three days post-fertilization. Confocal imaging revealed a marked reduction of Wnt⁺ mesenchymal cells, accompanied by altered nuclear morphology, diminished cell size, and reduced motility. These abnormalities were not associated with apoptotic cell death, pointing instead to upstream defects in mesenchymal progenitor specification or proliferation. Transcriptomic profiling demonstrated clear genotype-dependent clustering, with mutants enriched for pathways related to extracellular matrix remodeling, cytoskeletal regulation, and developmental processes, alongside strong enrichment of TCF/LEF transcription factor motifs, confirming impaired Wnt/β-catenin signaling.

    Functional assays highlighted the therapeutic potential of pathway modulation. Pharmacological inhibition of caspase-6 or RIPK1 partially restored mesenchymal cell numbers and improved fin fold integrity, implicating these factors in non-apoptotic regulation of mesenchymal progenitors. Modulation of thyroid hormone signaling produced genotype-specific effects: thyroxine treatment worsened fin fold lesions, whereas inhibition of thyroid hormone production or knockdown of thyroxine-binding globulin ameliorated phenotypes, suggesting functional crosstalk between thyroid hormone signaling and Wnt-mediated mesenchymal regulation. Importantly, transcriptomic analysis of KBG syndrome patients showed that the severity of clinical manifestations could not be explained solely by ANKRD11 mutation type, indicating that additional modifiers influence disease progression.

    In conclusion, this work establishes zebrafish as a robust model to study Ankrd11 deficiency and its skeletal consequences. The findings demonstrate that loss of Ankrd11 disrupts Wnt/β-catenin signaling, depletes mesenchymal progenitors, and impairs skeletal morphogenesis, linking cellular dysfunction to systemic abnormalities. The partial rescue achieved through pharmacological and hormonal modulation identifies potential therapeutic targets and underscores the translational relevance of this research. Collectively, these results advance mechanistic insight into KBG syndrome pathogenesis and lay the foundation for future strategies aimed at developing targeted therapies.