Diseño, desarrollo y validación de inmunoensayos para el control y diagnóstico diferencial de animales infectados y vacunados frente al virus de la peste porcina africana

• Autores: María Gabriela González García
• Directores de la Tesis: Paloma Rueda (dir. tes.), Patricia Sastre Antoranz (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2024
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Manuel Bautista Santa Cruz (presid.), Cinta Prieto Suárez (secret.), María Luisa de Arriba Martín (voc.), Jovita Fernández Pinero (voc.), Christian Gortázar (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Inmunología
      • Reacción antígeno-anticuerpo
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen

  • La peste porcina africana (PPA) está causada por el virus de la PPA (vPPA) y constituye una de las enfermedades infecciosas más significativas que afectan a las explotaciones porcinas y a suidos salvajes. La atenuación del virus mediante la sustitución de genes específicos (marcadores negativos) por genes reporteros (marcadores positivos) ha sido la estrategia más prometedora hasta la fecha para la obtención de candidatos vacunales frente al vPPA. En el proyecto europeo VACDIVA, se han generado diferentes candidatos vacunales, que permitan la diferenciación entre animales infectados y vacunados (DIVA) a nivel serológico.

    El objetivo principal del presente trabajo ha sido el desarrollo y diseño de un ensayo de diagnóstico de tipo DIVA, para cerdo doméstico y jabalí. Así, se expresaron las proteínas codificadas por los genes marcadores negativos, 9GL, pEP153R y CD2v, así como las proteínas reporteras, eGFP y mCherry; y se estudió su antigenicidad. Dos de estas, pEP153R de genotipo II y eGFP, se seleccionaron como antígenos para desarrollar un ensayo serológico DIVA, para acompañar a la vacuna candidata Lv17/WB/Rie1-DeltaEP153R-DeltaEP402R, así como a todos sus derivados, que tienen el gen EP153R delecionado y el gen eGFP insertado. Además, el ensayo incorporó la detección de anticuerpos frente a una proteína control, p72 o p30, presente tanto en la vacuna como en el virus parental.

    La plataforma de diagnóstico utilizada fue el ELISA. Este ensayo se evaluó con muestras de sueros de animales infectados y vacunados experimentalmente y muestras de suero de animales de campo de zonas libres de PPA. Utilizando la detección de anticuerpos frente a la p72 como referencia, el ELISA pEP153R mostró una sensibilidad del 75,3 % y una especificidad del 99,9 %. El menor valor de sensibilidad detectado fue debido al retraso en la seroconversión de los animales frente a la pEP153R, en comparación a la aparición de anticuerpos frente a la p72. Por otro lado, el ELISA eGFP mostró una sensibilidad del 90,0 % y especificidad del 99,9 %. A continuación, el ensayo se adaptó a un formato comercial y se validó en laboratorios nacionales de referencia, utilizando muestras de diversas matrices procedentes de animales de campo infectados o no infectados. Esta validación demostró la posible implementación del ensayo en programas de control de la enfermedad.

    Posteriormente, el ensayo se transfirió a la plataforma múltiple ELISA-microarray, para facilitar la detección simultánea de anticuerpos frente a todos los antígenos del ELISA DIVA (p72, p30, pEP153R genotipo II y eGFP) en un único ensayo. Además, se incluyeron dos antígenos adicionales, la pEP153R de genotipo I y la proteína E2 del virus de la peste porcina clásica. Los parámetros diagnósticos obtenidos en el ensayo séxtuple fueron comparables a los obtenidos en los ELISA individuales, demostrando la viabilidad de esta plataforma para facilitar el cribado de las muestras.

    Finalmente, el ensayo DIVA se adaptó a la tecnología de inmunocromatografía de flujo lateral (LFA), una plataforma que permite realizar un diagnóstico in situ. Los resultados obtenidos mostraron buenos parámetros diagnósticos en la detección de anticuerpos frente a la eGFP (LFA eGFP), mientras que no fue posible la detección de anticuerpos frente a la pEP153R en un formato rápido. No obstante, la combinación del ensayo LFA eGFP, junto con la detección de anticuerpos frente a la p72, podría ser de gran valor en el seguimiento de la vacunación.

    Los resultados presentados en esta tesis proporcionan nueva información acerca de marcadores DIVA para el diagnóstico diferencial de la PPA. Además, se han desarrollado nuevas herramientas diagnósticas, tanto a nivel laboratorial como de campo, que permitirían llevar a cabo una vigilancia más eficiente en aquellas zonas donde se apliquen las vacunas generadas en VACDIVA.