Essential functions of Cdt1 and Orc6 during origin licensing

• Autores: Marina Guerrero i Puigdevall
• Directores de la Tesis: Jordi Frigola Mas (dir. tes.), Anna Massaguer Vall-Llovera (tut. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Girona ( España ) en 2025
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel González Blanco (presid.), Ferran Feixas Geronès (secret.), Belén Gómez González (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina y Salud por la Universidad de Girona
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: TDX
• Resumen
  • español

    El proceso de preparación de los orígenes garantiza que las células eucariotas repliquen su ADN de manera precisa y una sola vez por ciclo celular. El complejo de ORC, junto con las proteínas de carga Cdc6 y Cdt1, cargarán el núcleo de la helicasa replicativa (M2-7), en forma de doble hexámero (DH). El proceso empieza con el ensamblaje del anillo de los cargadores de helicasa, alrededor del ADN de doble cadena (ORC/Cdc6 o OC). Posteriormente, este complejo recluta un segundo anillo, integrado por el núcleo de la helicasa y la proteína Cdt1 (M2-7/Cdt1 o MC). De manera secuencial, el acoplamiento entre ambos anillos (OC y MC) dará lugar al ensamblaje del DH.

    En levadura, todas las proteínas que intervienen en la preparación de los orígenes son esenciales. Conocer su función específica, a nivel molecular y de mecanismos, ha sido un área activa de investigación durante los últimos 15 años. Esta tesis tiene como objetivo entender la función esencial de dos de estas proteínas, Cdt1 y Orc6. Ambas comparten el hecho de ser las únicas que no están relacionadas con la superfamilia ATPasa Asociada a diversas Actividades celulares (AAA+).

    En esta tesis, descubrimos que la inserción del ADN durante la etapa de preparación ocurre a través de una serie de eventos sincronizados, en los que Cdt1 juega un papel esencial. El acoplamiento entre los complejos OC y MC permite la inserción del ADN de doble cadena en el M2-7. Este proceso requiere del extremo C terminal (C-WHD) de Cdt1. Sin este dominio, el M2-7 se parte en dos mitades. Específicamente, el C-WHD de Cdt1 interacciona con el C-WHD de Mcm6, y esta interacción permite el anclaje entre los anillos MC y OC, interaccionando con un dominio conservado en Orc5.

    Orc6 tiene dos dominios, el dominio N terminal (NTD) y el dominio C terminal (CTD), separados por una larga región no estructurada. Nuestros resultados sugieren que estos dominios tienen funciones independientes durante la etapa de preparación y sorprendentemente, ambos son funcionales incluso sin estar físicamente unidos. Mientras que el CTD de Orc6 contribuye al reclutamiento inicial del complejo MC por OC, el NTD es esencial en las últimas fases de la preparación. Específicamente, es necesario para cerrar y/o estabilizar la forma cerrada del M2-7. Finalmente, hemos desvelado cómo CDK inhibe el complejo ORC y asegura que el ADN sólo se copie una sola vez por ciclo celular. Mientras que la fosforilación de Orc2 inhibe estadios iniciales del reclutamiento del MC por OC, la fosforilación de Orc6 inhibe al final de la etapa de preparación, a través de su dominio NTD.

  • English

    Origin licensing ensures that eukaryotic cells replicate their DNA precisely once per cell cycle. The ORC complex, together with the licensing factors Cdc6 and Cdt1, load the core of the replicative helicase (M2-7), as a double hexamer (DH). Licensing starts assembling the helicase loaders ring around duplex DNA (ORC/Cdc6 or OC). Later, this complex recruits a second ring, integrated by the core of the helicase plus the loading factor Cdt1 (M2-7/Cdt1 or MC). In a stepwise manner, both rings (OC and MC) are stacked and ultimately, results in the DH assembling. In yeast, all the licensing proteins are essential. Their specific function, at molecular and mechanistic level, has been an active area of research for the last 15 years. This thesis aims to understand the essential function of two licensing factors, Cdt1 and Orc6. Both proteins are the only licensing factors not related to the ATPase-Associated with various cellular Activities (AAA+) superfamily. We found that DNA insertion during licensing occurs through a series of synchronized events in which Cdt1 plays a critical role. The stacking between the OC and the MC complexes enable the insertion of duplex DNA into the M2-7. This process requires the conserved C terminal winged-helix domain (C-WHD) of Cdt1. Without this domain, the M2-7 splits into two halves. Specifically, the C-WHD of Cdt1 must interact with the C-WHD of Mcm6, enabling the latching between the MC and the OC rings, through a conserved interaction with the Orc5 AAA+ lid. Orc6 has two domains, N terminal domain (NTD) and C terminal domain (CTD), separated by a long linker. Our results suggest, that these domains have independent functions during licensing and surprisingly, both domains are functional even if not physically linked. While the Orc6 CTD contributes to the initial recruitment of the MC by OC complex, the NTD is essential in the latest stages of licensing. Particularly, it is required to close and/or stabilize the closed form of the M2-7. Additionally, we also have unveiled how ORC’s CDK phosphorylation ensure once per cell cycle. While Orc2 phosphorylation inhibits the initial recruitment of the MC by the OC, Orc6 phosphorylation inhibits a latest stage in licensing, through its NTD