Complejo mayor de histocompatibilidad clase II porcino: polimorfismos e inmunopeptidomas propios y de patógenos de interés veterinario
- Autores: Carmen Teresa Celis Giraldo
- Directores de la Tesis: Manuel Alfonso Patarroyo Gutiérrez (dir. tes.), Raúl Manzano Román (codir. tes.), Antonio Muro Álvarez (tut. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2025
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Raúl Rivas González (presid.), María Carmen Tarradas Iglesias (secret.), Carlos Alberto Parra López (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Salud y Desarrollo en los Trópicos por la Universidad de Salamanca
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
- español
La especie porcina ha brindado grandes beneficios a la humanidad y, especialmente, la producción porcina dada la creciente demanda de carne de cerdo como fuente de proteína. Los sistemas de producción se enfrentan a diferentes retos y, entre ellos, están el manejo de las resistencias a los fármacos y el control de enfermedades infecciosas, algunas de gran impacto sanitario y económico. Enfermedades como la salmonelosis, colibacilosis y leptospirosis tienen un gran impacto en la salud animal y humana por su potencial zoonótico. El tratamiento de estas enfermedades con elevadas dosis de antibióticos ha favorecido el fenómeno de resistencia y aumentado, por tanto, el riesgo de morbilidad/mortalidad. Lo anterior hace necesario centrarse en la medicina preventiva, y especialmente, en las vacunas como alternativas a los antibióticos.
Sin embargo, la identificación de antígenos bacterianos candidatos a vacunas que logren estimular una amplia respuesta inmunitaria adaptativa es otro gran reto. Por ello, las vacunas disponibles frente a estos patógenos se basan fundamentalmente en plataformas de bacterias vivas o atenuadas. En los últimos años, los avances con técnicas proteómicas como la espectrometría de masas han contribuido al desarrollo de la inmunopeptidómica, un método bio-analítico que permite la identificación de epítopos bacterianos presentados en el contexto de las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) y que pueden ser incluidos en novedosas plataformas vacunales basadas en péptidos. Los estudios inmunopeptidómicos pueden también mejorar enormemente nuestra comprensión de las vías de procesamiento y presentación de los antígenos.
En la especie porcina no se han publicado estudios de inmunopeptidómica con moléculas CMH clase II. Las moléculas clase II del CMH se expresan en células profesionales presentadoras de antígenos como los macrófagos y las células dendríticas, entregando antígenos exógenos a los linfocitos T colaboradores CD4+, potenciando así la inmunidad adaptativa.
En este trabajo se llevó a cabo la tipificación basada en secuenciación del gen porcino homólogo al CMH-II humano (SLA-DRB1) en porcinos de razas criollas colombianas e híbridos comerciales, comparando los resultados con datos reportados a nivel mundial. Se identificaron 21 alelos en seis poblaciones diferentes de Colombia. La diversidad del gen SLA-DRB1 en las poblaciones porcinas colombianas analizadas fue baja, con la mayor diversidad alélica en las poblaciones de Manta, Casco de Mula y San Pedreño. El alelo 02:01:01 se encontró en 5 poblaciones analizadas y se evidenció una menor diversidad alélica en los porcinos domésticos que en el jabalí.
Por otra parte, se estimularon macrófagos obtenidos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de cerdos donantes homocigotos para el gen SLA-DRB1 con los patógenos Salmonella typhimurium, Escherichia coli y Leptospira pomona de forma independiente, durante un período de 20 horas. Las células infectadas se lisaron y los inmunocomplejos fueron capturados utilizando una columna de afinidad basada en el anticuerpo L243 unido a proteína A. Los péptidos eluidos fueron analizados por espectrometría de masas con el fin de identificar el mayor número de péptidos bacterianos posibles y con el fin de garantizar la calidad de las identificaciones utilizadas para el entrenamiento de la red neural ajustada. La mayoría de los péptidos identificados resultaron del procesamiento interno (97,89 %) mientras que los péptidos de origen bacteriano representaron un porcentaje menor (2,11%). De particular interés vacunal son los péptidos bacterianos identificados: 31 péptidos de Salmonella typhimurium, 3 de Leptospira pomona y 84 de E. coli. Se identificaron varios péptidos de la proteína de membrana externa-A y de la proteína chaperonina GroEL, que podrían ser considerados candidatos vacunales promisorios.
Finalmente, se utilizaron los péptidos identificados por espectrometría de masas para el entrenamiento de los predictores. Se trabajó con el servidor GibbsCluster que identifica motivos de unión al CMH-Clase II, NetMHCIIpan-4.0 para predecir la capacidad de elución de las moléculas analizadas ajustado con los alelos del estudio y con el predictor MixMHC2pred para estudiar la afinidad de unión con el SLA. Se observó que la mayoría de los péptidos aislados en el proceso de inmunopurificación fueron predichos por la red neural ajustada NetMHCIIpan-4.0. Sin embargo, encontramos diferencias en las predicciones de los motivos de elución para cada uno de los haplotipos analizados.
Como conclusión, el enfoque de inmunopeptidómica aplicado en este estudio fue una estrategia útil con la cual se logró la caracterización de los perfiles de elución de las moléculas clase II de tres individuos homocigotos. Los métodos aplicados y los resultados obtenidos pueden sentar las bases para i) el desarrollo de herramientas eficaces de predicción de epítopos inmunogénicos y ii) la selección de candidatos a vacunas a integrar en plataformas vacunales basadas en multi-epítopos, soluciones de gran interés para la prevención y manejo de enfermedades infecciosas en animales de producción.
- English
The porcine species has brought great benefits to mankind and, especially, pork production, given the growing demand for pork as a protein source. Production systems face different challenges and, among them, are the management of drug resistance and the control of infectious diseases, some of them of great sanitary and economic impact. Diseases such as salmonellosis, colibacillosis and leptospirosis have a great impact on animal and human health due to their zoonotic potential. The treatment of these diseases with high doses of antibiotics has favored the phenomenon of resistance and thus increased the risk of morbidity/mortality. This makes it necessary to focus on preventive medicine, and especially on vaccines as alternatives to antibiotics.
However, the identification of bacterial antigen candidates for vaccines that can stimulate abroad adaptive immune response is another major challenge. Therefore, available vaccines against these pathogens are mainly based on live or attenuated bacterial platforms. In recent years, advances with proteomic techniques such as mass spectrometry have contributed to the development of immunopeptidomics, a bio-analytical method that allows the identification of bacterial epitopes presented in the context of Major Histocompatibility Complex (MHC) molecules and that can be included in novel peptide-based vaccine platforms. Immunopeptidomics studies can also greatly improve our understanding of antigen processing and presentation pathways.
No immunopeptidomics studies with MHC class II molecules have been published in swine. MHC class II molecules are expressed on professional antigen-presenting cells such as macrophages and dendritic cells, delivering exogenous antigens to CD4+ helper T lymphocytes, thus enhancing adaptive immunity.
In this work, sequencing-based typing of the porcine gene homologous to human MHC-II (SLA-DRB1) was carried out in pigs of Colombian creole breeds and commercial hybrids, comparing the results with data reported worldwide. Twenty-one alleles were identified in six different populations in Colombia. The diversity of the SLA-DRB1 gene in the Colombian swine populations analyzed was low, with the highest allelic diversity in the Manta, Casco de Mula and San Pedreño populations. The 02:01:01 allele was found in 5 populations analyzed and there was less allelic diversity in domestic swine than in wild boar.
Moreover, macrophages obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of donor pigs homozygous for the SLA-DRB1 gene were independently stimulated with either Salmonella typhimurium, Escherichia coli or Leptospira pomona pathogens, for a period of 20 hours. Infected XXII cells were lysed and immunocomplexes were captured using an affinity column based on protein Abound L243 monoclonal antibody. The eluted peptides were analyzed by mass spectrometry to identify as many bacterial peptides as possible, and to ensure the quality of the identifications used for training the adjusted neural network. Most of the peptides identified resulted from internal processing (97.89 %) while peptides of bacterial origin accounted for a smaller percentage (2.11 %).
Of particular vaccine interest are the bacterial peptides identified: 31 peptides from Salmonella typhimurium, 3 from Leptospira pomona and 84 from E. coli. Several peptides of the outer membrane protein-A and the chaperonin protein GroEL were identified, which could be considered promising vaccine candidates.
Finally, the peptides identified by mass spectrometry were used to train the predictors. We worked with the GibbsCluster server that identifies MHC-Class II binding motifs, NetMHCIIpan-4.0 to predict the elution capacity of the analyzed molecules matched with the studied alleles, and with the MixMHC2pred predictor to study the binding affinity with SLA. It was observed that most of the peptides isolated in the immunopurification process were predicted by the adjusted neural network NetMHCIIpan-4.0® However, we found differences in the predictions of elution motifs for each of the analyzed haplotypes.
As conclusion, the immunopeptidomics approach applied in this study was a useful strategy with which the characterization of the elution profiles of class II molecules from three homozygous individuals was achieved. The methods applied and the results obtained can lay the foundation for i) the development of efficient tools for the prediction of immunogenic epitopes and ii) the selection of vaccine candidates to be integrated in multi-epitope based vaccine platforms, solutions of greatinterest for the prevention and management of infectious diseases in production animals.
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