Novel immunophenotypic approaches to improve the diagnostic study of mature T- and NK-cell neoplasms
- Autores: Francisco Javier Morán Plata
- Directores de la Tesis: Julia Almeida Parra (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Salamanca ( España ) en 2025
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Orfao (presid.), Enrique Colado Varela (secret.), Paula Carolina Fernández (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
INTRODUCCIÓN El sistema inmune desempeña un papel esencial en la defensa del cuerpo humano frente a patógenos y sustancias potencialmente nocivas, a través de la puesta en marcha, de forma coordinada y secuencial, de la respuesta inmune innata y adaptativa. La primera de ellas constituye una respuesta no específica y rápida, que se sirve de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRs, por sus siglas en inglés) y la producción de citoquinas proinflamatorias y proteínas del sistema del complemento. En la respuesta innata participan diferentes tipos celulares, como los neutrófilos, monocitos, macrófagos, células dendríticas, mastocitos, basófilos, eosinófilos, células naturales asesinas (natural killer -NK- en inglés) y células linfoides innatas. Por otra parte, la respuesta inmune adaptativa consiste en un tipo de respuesta muy específico y que, como su nombre indica, se adapta a cada tipo de antígeno, siendo crucial cuando la respuesta innata no es suficiente para acabar con la infección y, especialmente, al desarrollar la memoria inmunológica, que confiere protección frente a las reinfecciones. Esta respuesta adaptativa está mediada por los linfocitos T y los linfocitos B productores de anticuerpos.
En esta Tesis Doctoral nos vamos a centrar principalmente en los linfocitos T y NK. Los linfocitos T reconocen antígenos procesados (péptidos) presentados por las células presentadoras de antígenos y se desarrollan en el timo, hasta donde llegan progenitores generados en la médula ósea a partir de una célula madre hematopoyética multipotente, que migran a través de los vasos sanguíneos, para su diferenciación en el timo. En concreto, los timocitos (precursores T en el timo) sufren diferentes etapas de diferenciación, proliferación y selección, dando lugar a los linfocitos T maduros (naive) que abandonan el timo como células inmunocompetentes y autotolerantes. Durante estas etapas de diferenciación, se reordenan los genes del TCR y tiene lugar la selección positiva y negativa, garantizando la inmunocompetencia, eliminando los linfocitos T autorreactivos y generándose el linaje de células T reguladoras. Los linfocitos T maduros se clasifican según la expresión de las cadenas del TCR en linfocitos Tß y T, siendo los primeros los mayoritarios en sangre y que a su vez se clasifican en función de la expresión de los correceptores CD4 y CD8 en su membrana. Así, los linfocitos TßCD4+CD8- o linfocitos T colaboradores (T helper -Th-, en inglés) tienen principalmente una función inmunomoduladora, mientras que el resto de las subpoblaciones (TßCD4-CD8+, TßCD4-CD8-/+débil y TßCD4+CD8+), junto con las células T, ejercen funciones citotóxicas. Los linfocitos T colaboradores (Th) constituyen la fracción predominante de linfocitos T en sangre y desempeñan un papel fundamental gracias a la diversidad de subpoblaciones funcionales que tiene. Entre ellas se encuentran las células T foliculares colaboradoras (TFH, por sus siglas en inglés), los linfocitos T reguladores, ya mencionados anteriormente, y una gran variedad de poblaciones Th, como los linfocitos Th1, Th2, Th9, Th17, Th1/Th17 y Th22. Cada una de estas subpoblaciones se caracteriza por la expresión de determinados receptores de quimiocinas en su membrana, factores de transcripción y la secreción de diferentes patrones de citoquinas. Además, tanto las células T colaboradoras como citotóxicas se pueden dividir, de acuerdo con su grado de maduración, en diferentes estadios: naive, células madre de memoria T, células T de memoria (memoria central, memoria transicional y memoria efectora), y células T efectoras (tempranas y terminales).
Respecto a las células NK, son células citotóxicas de la respuesta innata debido a la ausencia de un reconocimiento específico de antígeno, y son fundamentales en la respuesta antitumoral y en las infecciones producidas por virus, principalmente. Las células NK se generan a partir de precursores en la médula ósea y su desarrollo ocurre tanto en la misma médula ósea como en los órganos linfoides secundarios, y en menor medida en otros tejidos, como el hígado, tejidos linfoides asociados a mucosa o el útero. Tradicionalmente, se ha considerado que estas células presentan dos subpoblaciones principales definidas por la expresión de CD16 y CD56: (i) células NK CD16-/+debilCD56brillante, que tienen principalmente funciones inmunomoduladoras y representan alrededor de un 10% de las células NK en sangre periférica; y (ii) células NK CD16+CD56+débil, que presentan funciones citotóxicas (secreción de citolisinas como perforina y granzimas), y son la población mayoritaria en sangre (~90%). En los últimos años se ha puesto en evidencia la existencia de otras poblaciones minoritarias de células NK, denominadas células NK no convencionales, entre las que destacan las células NK CD56negativas, las cuales se han visto expandidas en pacientes con tumores o con infecciones (por ejemplo, VIH, EBV, VHC, ) y las células NK de memoria o memoria-like, que se expanden en situaciones de reexposición a ciertas infecciones víricas o bacterianas.
Esta Tesis Doctoral se centra en las neoplasias derivadas de los dos grupos celulares referidos (linfocitos T y células NK). Los síndromes linfoproliferativos crónicos de células T y NK (SLPC-T/NK) engloban a un grupo muy heterogéneo de neoplasias derivadas de linfocitos T y NK maduros, algunas de las cuales tienen mal pronóstico y un curso agresivo. Actualmente, el diagnóstico de estas neoplasias y su posterior clasificación en categorías diagnósticas de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) o la Clasificación de Consenso Internacional (ICC) supone un reto, debido a su gran heterogeneidad clínico-biológica, la carencia de marcadores moleculares/genéticos en la mayoría de las categorías diagnósticas y su baja incidencia (10-15% de los linfomas no-Hodgkin). El diagnóstico de la clonalidad de células T/NK en pacientes con sospecha de SLPC-T/NK es difícil debido a que las células T malignas/clonales y las células T normales/policlonales presentan características tanto morfológicas como inmunofenotípicas similares. Este hecho, junto con las limitaciones de los métodos actuales de confirmación de clonalidad T/NK, dificulta su estudio diagnóstico en la práctica clínica. No obstante, en el caso de los SLPC de línea T, esta limitación se ha resuelto en los últimos años, gracias a la implementación de anticuerpos monoclonales que reconocen las isoformas TRBC1 y TRBC2, lo que permite evaluar la restricción de TRBC mediante citometría de flujo como marcador de clonalidad. Este método es rápido, preciso, reproducible, y tiene una concordancia elevada con el método de referencia del análisis de clonalidad T (estudio del reordenamiento de los genes TCRß y TCR mediante técnica de PCR).
Sin embargo, no existen métodos similares para confirmar fácilmente el carácter clonal de las expansiones de células T y NK. Si bien la clonalidad de las células T puede evaluarse mediante PCR, aún no hay un marcador universal de estudio de clonalidad para las células NK. Los métodos actuales, como el test HUMARA o la detección de mutaciones en STAT3 y otras mutaciones, solo son útiles en una proporción (pero no en el 100%) de los casos, y además requieren de purificación celular previa, altos costos y dificultad en la interpretación de los resultados.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Con los antecedentes descritos, planteamos la hipótesis de que nuevos marcadores inmunofenotípicos podrían ayudar a diferenciar las células NK clonales de las reactivas. Actualmente, las células NK se identifican mediante citometría de flujo por su patrón típico de expresión de CD56 y/o CD16, pero esta estrategia no permite identificar las células NK en aquellas condiciones en las cuales hay una expresión disminuida de alguno de los dos marcadores (por ejemplo, en expansiones NK reactivas o clonales). Por ello, la identificación de nuevos marcadores (o combinaciones de marcadores) fenotípicos y/o nuevas estrategias de identificación del total de las células NK sería de gran utilidad para su implementación en los laboratorios clínicos. Respecto a los SLPC-T, actualmente el mayor reto diagnóstico no es la confirmación de clonalidad T, como se ha mencionado, sino la clasificación en categorías OMS/ICC, debido a la gran heterogeneidad y solapamiento clínico-biológico entre ellas. Por lo tanto, se requiere una clasificación más racional que tenga en cuenta el conocimiento actual sobre las características biológicas de las células tumorales y su comparación con las células T normales. Dado que los SLPC-T pueden originarse en distintas poblaciones de células T bloqueadas en diferentes etapas de su maduración, una caracterización inmunofenotípica basada en la comparación con las subpoblaciones (madurativas y funcionales) T normales ayudaría a identificar su origen celular potencial y, por tanto, mejorar en un futuro la clasificación diagnóstica. Por otro lado, la definición de los perfiles inmunes específicos de cada categoría de SLPC-T podría contribuir a definir mejor y comprender las interacciones entre las células tumorales y el sistema inmunológico (micromedioambiente tumoral) en cada grupo específico de neoplasia T madura.
Con estos antecedentes, la hipótesis general de esta Tesis Doctoral es que una comprensión más detallada del fenotipo tanto de las células tumorales como de las células inmunitarias normales podría mejorar significativamente el estudio diagnóstico de los SLPC-T/NK.
Sobre esta hipótesis, el objetivo general del estudio ha sido identificar nuevos patrones y marcadores fenotípicos con el fin de mejorar tanto el diagnóstico de clonalidad en las neoplasias de células NK maduras como la clasificación de los SLPC-T en las distintas categorías diagnósticas.
Para alcanzar este propósito general, se establecieron tres objetivos específicos: 1. Seleccionar el marcador o combinación de marcadores más óptimos para identificar de manera inequívoca el conjunto de las células NK en la sangre, tanto de donantes sanos como de pacientes con distintas condiciones patológicas (incluidas neoplasias) en las cuales los marcadores clásicos de células NK (CD56 y/o CD16) están infraexpresados, con un enfoque particular en la identificación de marcadores subrogados de clonalidad NK.
2. Clasificar las células tumorales de las distintas categorías de SLPC-T en compartimentos específicos madurativos y funcionales del compartimento de células T, de acuerdo con sus similitudes fenotípicas con su contrapartida normal, y determinar su asociación con el subtipo diagnóstico de la enfermedad.
3. Analizar en detalle la distribución del sistema inmunológico innato y adaptativo normal en la sangre periférica de pacientes con neoplasias de células T maduras en el momento del diagnóstico, con especial atención a las alteraciones en los compartimentos funcionales y de maduración de las células T normales residuales.
MATERIAL, MÉTODOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN Desarrollo e identificación de una nueva estrategia de análisis para mejorar la identificación de las células NK clonales en sangre periférica, y, de manera indirecta, su contrapartida normal/reactiva.
En el primer objetivo de la tesis doctoral nos centramos en las células NK, que como se ha referido, actualmente se identifican gracias a los marcadores CD56 y CD16 (conjuntamente con CD3, para excluir los linfocitos T); no obstante, esta estrategia no resulta válida en una serie de situaciones (patológicas) en las cuales la expresión de alguno de ellos (mayoritariamente CD56) es negativo/positivo muy débil, como ocurre frecuentemente en procesos reactivos (infecciones) o en neoplasias de células NK. Se ha descrito que los receptores activadores CD314 (NKG2D), CD335 (NKp46) y NKp80 se expresan en la membrana celular de todas las células NK. Por tanto, se podrían proponer como alternativas más robustas para identificar la totalidad del compartimento NK en sangre periférica, tanto en individuos sanos como en pacientes con distintas enfermedades asociadas a una expresión disminuida de CD56 o CD16.
En nuestro primer objetivo nos propusimos identificar un marcador universal, robusto y específico para las células NK de sangre periférica, capaz de diferenciar entre células normales, reactivas y clonales, incluso cuando la expresión de los marcadores clásicos está alterada (disminuida), y así ser utilizado en laboratorios de diagnóstico para la identificación de las células NK circulantes en sangre.
Para ello, se analizaron un total de 156 muestras de sangre periférica de donantes sanos y pacientes con procesos reactivos y neoplasias de células NK. La expresión de los marcadores fue evaluada mediante citometría de flujo, siguiendo los protocolos estandarizados de EuroFlow. En primer lugar, se testaron los marcadores CD314, CD335 y NKp80 mediante anticuerpos monoclonales conjugados con distintos fluorocromos para identificar (de acuerdo con su stain index, SI) el de mayor resolución a la hora de identificar el conjunto de las células NK y discriminarlas del resto de los leucocitos de la muestra. Una vez identificado el mejor anticuerpo (reactivo) para esta finalidad, se validó en distintas condiciones (sujetos con procesos reactivos y pacientes con neoplasias de células NK), así como en condiciones de estrés celular, a través de ensayos in vitro. Por último, y dado que NKp80 también se expresa en células T, nos propusimos analizar su expresión en linfocitos T.
Nuestros resultados confirmaron que el anticuerpo monoclonal NKp80 (en cualquiera de sus clones/conjugados testados) se expresa de manera universal en prácticamente todas las células NK, con un SI significativamente mayor que CD314 y CD335 (p<0.001). Sin embargo, por sí solo no permite la identificación de las dos subpoblaciones mayoritarias de células NK, CD56brillante y CD56+débil. Posteriormente, comparamos la nueva estrategia de identificación del total de las células NK con NKp80 con la estrategia convencional (CD16 + CD56) y observamos una alta concordancia entre ellas, tanto en adultos como en niños sanos, aunque en niños NKp80 permitió detectar un mayor número de células NK CD56negativas, que no se identificaban con la estrategia convencional. Para validar NKp80 como el marcador óptimo para la identificación del total de las células NK, se sometieron muestras seleccionadas de sangre de sujetos sanos a condiciones de estrés o activación, y confirmamos que el impacto de estas condiciones sobre el descenso del SI de NKp80 es menor que en las moléculas tradicionales (CD16 o CD56).
Además, en procesos reactivos y clonales, la inclusión de NKp80 mejoró significativamente la identificación de células NK. En especial, en los casos clonales, la estrategia clásica de selección de células NK no permitió identificar 20% en el 53% de los casos (9/17), mientras que la adición de NKp80 la mejoró significativamente (p<0.01), especialmente en combinación con CD16, hasta alcanzar el 88% de los casos (15/17). Sin embargo, en un 29% de los casos las células clonales mostraron una baja o nula expresión de NKp80, por lo que se recomienda la inclusión de NKp80, CD16 y CD56 cuando hay una alta sospecha de neoplasia NK para una correcta identificación.
El análisis de la expresión de NKp80 en las células T y sus principales subpoblaciones reveló que se expresa en una fracción de las células T citotóxicas (TCD8+ y TCR+) de forma predominante, en comparación con las células TCD4+ (p<0.001), sobre todo en adultos (vs. niños). Además, como era de esperar al tratarse de un marcador asociado a función de citotoxicidad, observamos que conforme aumenta el estadio madurativo de las células T (desde naive a efectoras terminales), el porcentaje de células que expresan NKp80 es mayor.
Como conclusión de este primer objetivo de la Tesis Doctoral, podemos decir que describimos y validamos una nueva estrategia para la identificación de células NK normales y reactivas, basada en la combinación de CD16 y NKp80 (tras excluir las células T CD3+) que mejora la estrategia convencional de identificación de células NK basada en CD16+ y/o CD56+ utilizada actualmente por la mayoría de los laboratorios diagnósticos. Sin embargo, en los casos de linfocitosis NK con sospecha de ser patológicas (aberrantes), debe considerarse la adición de CD56 a la combinación NKp80+CD16 para una identificación más precisa de las células NK normales frente a las clonales, debido a la expresión aberrante (ausencia) de NKp80 por las células NK clonales en una proporción significativa de pacientes con neoplasia de células NK. En este sentido, describimos por primera vez un marcador subrogado de clonalidad NK para el diagnóstico de SLPC de células NK.
Fenotipo madurativo y funcional asociado de las células tumorales de las neoplasias de células T maduras.
Las neoplasias de células T derivadas de células T precursoras o maduras incluyen dos grupos principales de enfermedades: las neoplasias precursoras T-linfoblásticas (LLA-T) y los SLPC-T, ya comentados anteriormente. El diagnóstico y clasificación de los SLPC-T, a pesar de los avances recientes en los que se tienen en cuenta múltiples factores como las características clínicas, localización, morfología, inmunofenotipo o algunas alteraciones genéticas/moleculares, sigue siendo un reto diagnóstico y es, en general, poco reproducible. Por este motivo, en el segundo objetivo de la tesis clasificamos las células tumorales de diferentes subtipos diagnósticos de las neoplasias T en compartimentos concretos madurativos y funcionales, basándonos en sus similitudes fenotípicas con las múltiples poblaciones normales de células T, con la finalidad de definir los patrones inmunofenotípicos característicos de las distintas categorías diagnósticas de SLPC-T que pudieran aportar información sobre la posible célula de origen de la enfermedad, y contribuir a mejorar la clasificación de los T-CLPD. Para ello, se incluyeron en el estudio un total de 86 pacientes diagnosticados de SLPC-T (n=81) o LLA-T (n=5) y empleamos técnicas de citometría de flujo y el programa de análisis Infinicyt. Se generó una base de datos utilizando muestras de sangre de seis donantes sanos pareados por sexo y edad, como plantilla de los perfiles inmunofenotípicos de las subpoblaciones normales de células T, con los cuales se compararon las células tumorales de cada paciente, para establecer el patrón madurativo y funcional correspondiente. Seguidamente, las células tumorales se clasificaron según el fenotipo de las principales subpoblaciones funcionales de células T, en células TFH, Treg y Th. De acuerdo con referencias previas, confirmamos que las células tumorales del linfoma nodal de células T foliculares colaboradoras y la leucemia/linfoma T del adulto presentaron fenotipos que asemejaban a los de las células TFH y Treg, respectivamente. Por el contrario, las células tumorales de las demás categorías diagnósticas incluidas en el estudio se clasificaron como células Th. Centrándonos en el perfil madurativo y funcional de las células tumorales, identificamos perfiles fenotípicos predominantes en las diferentes categorías. Así, las células tumorales de la leucemia prolinfocítica T (abreviada como T-PLL por sus siglas en inglés) mostraron fenotipos correspondientes a un estado madurativo de una célula naive-memoria central con una heterogeneidad funcional elevada. En el síndrome de Sézary/micosis fungoide (SS/MF), las células tumorales predominantemente tenían perfiles correspondientes a células de memoria (memoria transicional en las células de MF, frente a un predominio de memoria central en el SS) , con un fenotipo Th restringido a células Th2 o Th17. Por su parte, en la leucemia de células T grandes granulares (abreviada como T-LGLL por sus siglas en inglés), las células tumorales se encontraban principalmente en la etapa madurativa más terminal (efectora terminal), aunque también se observaron por primera vez fenotipos de células efectoras tempranas. El perfil funcional de las T-LGLL se correspondía con un perfil exclusivamente restringido a células Th1 (asociado o no a una disminución de la expresión de CD183, característico de activación Th1). Además, merece la pena destacar que las células tumorales de pacientes con mutaciones en STAT3 mostraban predominantemente este perfil (Th1 CD183). Sin embargo, hay que señalar que, a pesar de la presencia de fenotipos de maduración predominantes en cada categoría de SLPC-T, también se evidenció heterogeneidad dentro de cada categoría. En resumen, nuestros hallazgos en relación con el segundo objetivo de la tesis sugieren que el grado de heterogeneidad fenotípica en los perfiles relacionados con Th dentro de los subtipos diagnósticos individuales de SLPC-T se restringe progresivamente desde los estadios menos maduros hasta los subtipos tumorales de células T más diferenciadas. Específicamente, las células tumorales de pacientes en etapas de maduración más tempranas (por ejemplo, T-PLL) mostraron una mayor plasticidad Th en comparación con las células T-LGLL más maduras, en consonancia con su menor potencial de diferenciación. Cabe reseñar que ciertos patrones madurativos de las células tumorales podrían ser útiles para mejorar el diagnóstico diferencial entre categorías diagnósticas distintas, como la T-ALL vs. la T-PLL o el SS vs. la MF. Además, destacamos que el fenotipo Th1 CD183 podría servir como un marcador subrogado de la presencia de mutaciones somáticas en STAT3 en la T-LGLL de línea T CD8.
Distribución de las poblaciones normales de leucocitos en sangre periférica de pacientes con neoplasias de células T maduras al diagnóstico.
Como se ha comentado previamente, el sistema inmunológico desempeña un papel crucial en la inmunovigilancia tumoral. La progresión de los tumores no solo implica la pérdida de esta vigilancia, sino que también conduce a un estado de inmunodeficiencia. Dado el papel bien establecido del sistema inmunológico en general, y de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral en particular, la inmunoterapia (incluyendo tratamientos que modulan la respuesta inmune del paciente para lograr beneficios terapéuticos) se ha convertido en un enfoque clave en la oncología clínica moderna. Las interacciones entre las células tumorales de los SLPC-T y las células inmunitarias del microambiente pueden desempeñar un papel crucial en los fallos de la inmunovigilancia y la progresión de la enfermedad, pero los perfiles inmunológicos alterados en sangre de los pacientes con SLPC-T siguen siendo en gran parte desconocidos. Por ello, en nuestro tercer objetivo nos propusimos investigar la distribución del sistema inmunológico residual en tres categorías diagnósticas de SLPC-T: T-PLL, SS/MF y T-LGLL. Estas entidades sirven como modelos tumorales de células T neoplásicas que se encuentran en tres estadios madurativos diferentes, naive/memoria central, memoria y efectoras terminales, respectivamente, como describimos en el trabajo anterior. En el presente trabajo, se incluyeron muestras de sangre periférica de un total de 47 pacientes al diagnóstico (14 con T-PLL, 7 con SS/MF y 26 con T-LGLL). Para realizar la monitorización del sistema inmune utilizamos técnicas de citometría de flujo tras marcar las muestras de sangre con el panel TCD4 de EuroFlow; el análisis de los datos se realizó con el programa informático Infinicyt. Teniendo en cuenta que la distribución de las células inmunitarias en sangre cambia a lo largo de la vida, incluimos 110 donantes sanos pareados por sexo y edad con los pacientes, para normalizar los datos. En general, observamos que la distribución en sangre de las células inmunitarias está profundamente alterada en la T-PLL; esta alteración se caracteriza por un aumento significativo en el recuento de monocitos, células dendríticas, células B, células NK y células linfoides innatas (especialmente de las ILC3), junto con una reducción de las células T normales circulantes. Además, los monocitos, las células NK y las células linfoides innatas aumentan significativamente en los pacientes que progresan vs. aquellos en los que la leucemia no ha progresado en el tiempo de seguimiento. Estos hallazgos indican que la leucocitosis característica de la T-PLL, aunque predominantemente está influenciada por las células tumorales circulantes, también se debe a ciertas poblaciones mieloides y linfoides normales. Al contrario que la T-PLL, el SS/MF se caracterizó por un aumento del número de neutrófilos, acompañado de una disminución del número de células dendríticas, células NK y del compartimento citotóxico de células T, lo que podría reflejar una mayor migración de estas células desde la sangre hacia la piel. Por su parte, los pacientes con T-LGLL presentaron la alteración inmunológica más leve, la cual depende del linaje TCD4+ vs. TCD8+ de las células clonales y la presencia de mutaciones en STAT3 en los casos de TßCD8+ T-LGLL. Merece destacar que en este trabajo describimos por primera vez que una disminución no solo de los neutrófilos, sino también de las células dendríticas, células NK y, en menor medida, basófilos, podría servir como un marcador subrogado de mutación en STAT3 en los pacientes con T-LGLL de línea CD8.
Un análisis más detallado reveló una reducción significativa de los compartimientos de maduración más tempranos T normales (células naive y de memoria central) en la T-PLL y el SS/MF, mientras que, en general, en la T-LGLL permanecieron dentro de los rangos normales. Estos hallazgos podrían indicar una posible derivación en la producción tímica de células T normales hacia las células T tumorales (por ejemplo, células T naive).
Por tanto, como conclusión del tercer trabajo, nuestros hallazgos revelan que los tres subtipos de SLPC-T analizados presentan alteraciones en la sangre periférica en el momento del diagnóstico en todos los compartimentos celulares del sistema inmunológico, que abarcan tanto la inmunidad innata como la adaptativa. El grado de deterioro del sistema inmunológico depende en gran medida de la categoría diagnóstica de la enfermedad, con una inmunodeficiencia que varía de grave a moderada y leve, (acompañada de una alteración progresivamente menor en las etapas más tempranas de maduración de los linfocitos T residuales normales) en la T-PLL, el SS/MF y la T-LGLL, respectivamente.
CONCLUSIONES Con respecto al primer objetivo de esta Tesis Doctoral, centrado en la identificación de un marcador de células NK más robusto y/o la mejor combinación de marcadores y estrategia de análisis para mejorar la detección de células NK (tanto clonales como normales/reactivas) en muestras de sangre periférica: 1. NKp80 es el marcador más fiable y sólido (de los tres marcadores no convencionales evaluados) para identificar toda la población de células NK en sangre periférica. Sin embargo, también se expresó en compartimentos de células T citotóxicas, lo que requiere la inclusión de CD3 para excluir las células T, al igual que en la estrategia convencional.
2. El marcador NKp80, por sí solo, no permite discriminar las dos principales subpoblaciones de células NK, lo que implica que para identificarlas con precisión, es necesario incluir al menos uno de los marcadores clásicos (CD56 o CD16). De estos últimos, encontramos que CD16 (junto con NKp80) es la mejor combinación para identificar células NK normales/reactivas y sus principales subpoblaciones, debido a la frecuente expresión disminiuda o incluso ausente de CD56 en las células NK de niños sanos y adultos con procesos reactivos.
3. El uso combinado de los tres marcadores (junto con CD3) permite detectar dos poblaciones minoritarias de células NK (no clásicas) en sujetos sanos y con procesos reactivos. Una de ellas se caracteriza por la ausencia de NKp80 y un patrón típico de CD56 y CD16, mientras que la otra presenta un perfil NKp80 CD16/lo CD56/lo. Ambas son más frecuentes en niños que en adultos, y su función aún es desconocida.
4. Para la identificación precisa de células NK aberrantes/clonales, se recomienda el empleo de los tres marcadores de células NK (CD16, CD56 y NKp80), y no solo de CD16 y NKp80, dada la frecuente reducción de la expresión de uno o más de estos marcadores.
5. La ausencia de expresión de NKp80 en poblaciones aberrantes de células NK (detectada de un 25-30% de los casos de SLPC de células NK) se propone como un nuevo marcador subrogado de clonalidad NK.
Con respecto al segundo objetivo, enfocado en la clasificación de las células tumorales de diferentes neoplasias de células T maduras según su fenotipo madurativo y funcional, y su relación con el subtipo diagnóstico de la enfermedad: 6. En concordancia con su supuesto origen celular, las células tumorales del linfoma nodal de células TFH y de la leucemia/linfoma de células T del adulto presentan perfiles fenotípicos similares a los de las células TFH y Treg normales, respectivamente. Por el contrario, todas las demás categorías diagnósticas incluidas en nuestro estudio presentan un fenotipo de células T clásicas (helper) o naive, pero no de células TFH o Treg.
7. Las células tumorales de los diferentes subtipos de SLPC-T muestran patrones de maduración distintos, que abarcan todos los compartimentos madurativos de las células T normales, desde las células de la T-PLL (que presentan predominantemente un perfil de células N o N/CM) hasta las células de T-LGLL (que se asemejan en su mayoría a células efectoras terminales). Las demás categorías muestran fenotipos similares a distintos subtipos de células T de memoria, lo que podría reflejar el compartimento de células T del que cada categoría deriva.
8. El perfil funcional asociado a cada categoría de células tumorales es más heterogéneo en comparación con su estadio de maduración, y se va reduciendo progresivamente desde las categorías menos maduras (como en la T-PLL, donde las células tumorales presentan un fenotipo funcional muy heterogéneo) hasta los subtipos más diferenciados (e.g., T-LGLL, que tiene un único perfil Th). Las demás categorías muestran un comportamiento intermedio, lo que apoya la asociación entre el fenotipo de maduración de las células tumorales y su plasticidad funcional.
9. A pesar de los patrones fenotípicos específicos observados en cada categoría diagnóstica de SLPC-T, dentro de cada una de ellas son comunes los perfiles tumorales heterogéneos en términos de maduración y función Th, lo que podría explicar la heterogeneidad clínica y la distinta evolución de la enfermedad dentro de cada entidad, especialmente en la T-PLL y en la TßCD8 LGLL con mutación en STAT3.
10. El fenotipo madurativo y funcional asociado de las células tumorales descrito en este estudio podría ayudar a identificar su contrapartida celular normal, contribuyendo así a una mayor precisión diagnóstica.
11. El patrón fenotípico de las células tumorales constituye una herramienta relevante para el diagnóstico de estas neoplasias, proporcionando información valiosa para el diagnóstico diferencial entre T-ALL y T-PLL, así como entre SS y MF. Además, podría servir como un marcador subrogado de mutaciones en STAT3 en pacientes con TßCD8 LGLL.
En cuanto al tercer y último objetivo de este trabajo, centrado en analizar la distribución de las células inmunitarias innatas y adaptativas en la sangre de pacientes no tratados con neoplasias de células T maduras en el momento del diagnóstico, con un enfoque especial en los compartimentos funcionales y de maduración de las células T normales residuales: 12. Las neoplasias de células T maduras presentan alteraciones marcadas en distintos compartimentos del sistema inmunológico, que afectan tanto a la inmunidad innata como adaptativa.
13. Las alteraciones del sistema inmunológico están influenciadas por la categoría diagnóstica de SLPC-T y, en consecuencia, por el fenotipo de maduración de las células tumorales. Esto da lugar a un espectro de inmunodeficiencia secundaria, que varía desde grave en la T-PLL, moderada en el SS/MF y más leve en la T-LGLL.
14. El mayor deterioro en el perfil inmunológico se encontró en la T-PLL, caracterizado por una marcada reducción en el número de células T normales, junto con un aumento en las cifras de monocitos, células dendríticas, células B, células NK e ILC circulantes, especialmente (en el caso de los monocitos, células NK e ILC2) en los pacientes que progresaron, lo que sugiere un posible papel de estas células inmunitarias (aún desconocido) en la evolución de la enfermedad. En el SS/MF, el deterioro es más leve, caracterizado por un aumento en sangre del número de neutrófilos y una reducción en las células dendríticas, NK y T citotóxicas, probablemente debido a su migración hacia la piel. Por otro lado, la T-LGLL presenta las alteraciones más leves, ya que solo se detecta reducción del número de neutrófilos, basófilos, células B y células NK en los casos con mutación en STAT3.
15. Este perfil inmunológico característico de los casos de TßCD8 LGLL con mutación en STAT3 podría servir como un marcador subrogado de mutaciones en STAT3 en estos pacientes.
16. La T-PLL y el SS/MF muestran perfiles alterados similares en las células T normales, con una marcada reducción en el número de células T en los compartimentos menos maduros. En cambio, la T-LGLL presenta alteraciones inmunológicas mucho más leves, lo que sugiere la existencia de una alteración progresivamente menor en las primeras etapas de maduración de los linfocitos T normales residuales, desde la T-PLL y SS/MF hasta la T-LGLL. Este hallazgo podría indicar una producción deficiente de células T en la T-PLL y el SS/MF, y en menor medida, también en la T-LGLL.
